肾小管源性CCN1通过αvβ5-STAT6-ARG1轴重编程巨噬细胞促进肾脏修复的机制研究

《Cell Death & Disease》：Tubule-derived CCN1 drives renal repair via αvβ5-STAT6-ARG1-dependent reprogramming of macrophages

本研究针对急性肾损伤（AKI）后巨噬细胞调控机制不清的问题，开展了肾小管源性CCN1调控巨噬细胞功能促进肾脏修复的主题研究。结果表明：缺血再灌注（I/R）损伤诱导肾小管上皮细胞（RTECs）分泌CCN1，通过αvβ5整合素激活巨噬细胞STAT6-ARG1通路，促进促修复性Arg1+巨噬细胞分化，进而增强肾小管增殖并改善肾功能。该发现揭示了全新的肾小管-免疫细胞对话机制，为缺血性AKI提供了潜在治疗靶点。

　　

当肾脏突然遭遇缺血打击时，医学术语称为急性肾损伤（AKI）的病理过程便悄然启动。这种常见临床综合征影响着全球数百万患者，其中超过半数重症监护室患者会受到波及，每年导致超200万人死亡。更严峻的是，AKI若修复不全，会进展为慢性肾脏病（CKD），形成恶性循环。在众多致病因素中，肾脏缺血后再恢复血流供应（即缺血再灌注损伤，I/R）是最主要的诱因之一。因此，深入解析肾脏自我修复的细胞分子机制，寻找促进组织再生的关键靶点，成为肾病研究领域的迫切需求。

长期以来，免疫细胞尤其是巨噬细胞在肾脏损伤修复中的双重作用备受关注。它们既可能释放炎症因子加剧损伤，也能转化为修复表型促进组织愈合。然而，肾脏固有细胞如何精准调控巨噬细胞功能转变的分子桥梁，始终是未解之谜。细胞通讯网络因子1（CCN1）作为一种分泌性基质细胞蛋白，早在AKI早期就显著上调，被认为是损伤预警标志物。但这条由肾小管上皮细胞（RTECs）发出的“分子信号”，能否以及如何影响巨噬细胞的行为，最终协调肾脏修复进程？这项发表于《Cell Death & Disease》的研究给出了系统性的答案。

研究团队综合运用了多种关键技术方法：通过小鼠肾脏缺血再灌注（I/R）模型模拟临床AKI进程；利用肾小管特异性CCN1敲低（通过肾盂注射AAV9-Ksp-shCCN1腺相关病毒构建）和重组CCN1蛋白注射进行功能增益与缺失验证；采用骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）体外培养体系探究直接调控效应；结合RNA测序（RNA-seq）与贝叶斯棱镜（BayesPrism）反卷积算法解析巨噬细胞亚群变化；通过免疫共沉淀-质谱（Co-IP/MS）技术筛选CCN1相互作用蛋白；建立Transwell共培养系统评估巨噬细胞-肾小管上皮细胞互作；并借助流式细胞术、免疫荧光、Western blot等技术进行表型与机制验证。部分临床相关性分析还参考了美国国立卫生研究院肾脏精准医学项目（KPMP）的单细胞RNA测序数据库。

CCN1在I/R-AKI肾小管中上调并分泌

研究首先证实了CCN1在肾脏损伤中的早期应答特性。在小鼠I/R模型中，肾小管上皮细胞在损伤24小时即出现CCN1的显著上调，蛋白与mRNA水平持续升高至72小时，且血清CCN1浓度同步增加。人源数据库（KPMP）分析显示AKI患者肾小管同样高表达CCN1。重要的是，免疫荧光显示CCN1阳性的肾小管与浸润的F4/80⁺巨噬细胞空间毗邻，提示潜在旁分泌作用。体外实验进一步验证，缺氧/复氧（H/R）和H₂O₂处理的人肾小管上皮细胞（HK-2）均能显著增强CCN1的表达与分泌。

外源性CCN1通过调控巨噬细胞缓解AKI

为明确CCN1的生理功能，研究人员尾静脉注射重组CCN1蛋白。结果显示，CCN1治疗显著降低了血清尿素氮、肌酐水平，减轻了肾组织病理损伤和损伤标志物KIM-1的表达。转录组富集分析（GSEA）表明，CCN1的作用与免疫反应、巨噬细胞激活通路密切相关。流式细胞术检测发现，CCN1处理增加了肾脏中CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞总数，并特异性提升了Ly6C^-亚群的比例，而对传统M1/M2标志物（CD86、CCR2、CD206）影响不显著。

肾小管特异性CCN1敲低加剧AKI并削弱巨噬细胞应答

为了逆向验证，研究团队构建了肾小管上皮细胞特异性CCN1敲低小鼠模型。与对照组相比，敲低小鼠在I/R后表现出更严重的肾功能障碍（尿素氮、肌酐升高）和组织损伤（H&E评分、KIM-1表达增加）。关键的是，肾脏内F4/80⁺巨噬细胞浸润明显减少，流式检测证实总巨噬细胞及Ly6C^-亚群均显著下降。这证明内源性肾小管源CCN1是招募和调控巨噬细胞所必需的。

CCN1直接重编程巨噬细胞向修复表型分化

体外骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）实验揭示，CCN1处理不仅促进了Ly6C^-MHCII⁺成熟巨噬细胞的分化（流式检测比例从1.78%升至48.1%），还增强了细胞的迁移能力（划痕实验和Transwell迁移实验证实），但对吞噬功能无显著影响。表型分析再次确认CCN1特异性增加Ly6C^-细胞，而不改变传统M1/M2标志。

CCN1激活的巨噬细胞通过旁分泌促进肾小管上皮细胞增殖

RNA-seq分析发现，CCN1处理的巨噬细胞上调了“促修复巨噬细胞”标志基因（如Pdgfb, Igf1, Hbegf, Vegfa）和“ECM重塑巨噬细胞”标志（如Arg1）。ELISA检测证实IGF-1和PDGF-BB分泌增加。共培养实验证明，CCN1预处理的巨噬细胞可显著促进下层HK-2细胞的Edu⁺增殖比例（流式检测从12.4%增至52.9%）。体内实验进一步显示，CCN1敲低小鼠肾脏Ki67⁺增殖细胞减少，而巨噬细胞清除实验则完全阻断了CCN1的促增殖作用，明确了巨噬细胞是CCN1发挥修复功能的关键媒介。

反卷积分析鉴定CCN1诱导ARG1⁺促修复巨噬细胞

研究应用BayesPrim算法对批量RNA-seq数据进行反卷积，解析巨噬细胞亚群变化。结果显示，在静息和LPS/IFN-γ刺激条件下，CCN1处理均显著富集了Arg1^hi巨噬细胞亚群。Western blot、qPCR和流式细胞术均在蛋白、mRNA和细胞水平验证了CCN1对ARG1表达的上调作用，并检测到ARG1酶活性和尿素产量升高。体内免疫荧光显示，I/R肾脏中ARG1⁺F4/80⁺巨噬细胞增多，且与CCN1高表达肾小管相邻；而肾小管CCN1敲低则显著减少了ARG1⁺巨噬细胞数量。

ARG1介导CCN1驱动的巨噬细胞促增殖效应

使用ARG1抑制剂Numidargistat进行处理，发现其可逆转CCN1引起的巨噬细胞促修复因子（Igf1, Pdgfb, Vegfa）mRNA上调和IGF-1、PDGF-BB分泌增加。在共培养体系中，抑制剂也显著抑制了CCN1激活的巨噬细胞对HK-2细胞增殖的促进作用，证明ARG1是CCN1调控通路中的关键效应分子。

CCN1通过α_vβ₅整合素激活巨噬细胞STAT6/ARG1通路

机制探索层面，GSEA提示STAT信号通路被激活。Western blot证实CCN1处理增强了STAT6磷酸化。Co-IP/MS联合筛选及BioGRID数据库比对，鉴定出整合素ITGAV和ITGB5（即α_vβ₅）是CCN1在巨噬细胞表面的直接结合蛋白。分子对接和Co-IP实验验证了二者结合。功能上，α_vβ₅整合素抑制剂可有效阻断CCN1诱导的STAT6磷酸化和ARG1表达上调，从而明确了CCN1-α_vβ₅-STAT6-ARG1信号轴。

综上所述，本研究揭示了一条全新的肾脏损伤修复调控通路：缺血再灌注损伤激发肾小管上皮细胞高表达并分泌CCN1；CCN1作为配体与浸润巨噬细胞表面的α_vβ₅整合素结合，激活下游STAT6信号通路，进而上调精氨酸酶1（ARG1）的表达，驱动巨噬细胞向促修复表型转化；这些被“重编程”的巨噬细胞通过分泌IGF-1、PDGF-BB等生长因子，最终促进肾小管上皮细胞增殖与肾脏功能恢复。该研究不仅深化了对肾脏内细胞间通讯的认识，更重要的是将CCN1、α_vβ₅整合素、STAT6-ARG1轴确立为缺血性急性肾损伤的潜在治疗靶点，为开发促进肾脏再生、改善AKI预后的新策略提供了坚实的理论依据和实验基础。