α1-抗胰蛋白酶通过抑制Caspase 3/GSDME依赖性巨噬细胞焦亡介导急性痛风性炎症的自发缓解

《Inflammation》：Alpha-1 Antitrypsin Mediates Spontaneous Resolution of Acute Gouty Inflammation Via Inhibiting Caspase 3/GSDME-dependent Macrophage Pyroptosis

本研究聚焦急性痛风自发缓解的机制，揭示了巨噬细胞中Caspase 3/GSDME依赖性焦亡通路的关键作用。研究人员通过临床样本分析、细胞实验及动物模型证实，急性痛风患者体内升高的α1-抗胰蛋白酶(AAT)可通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)内化至巨噬细胞，直接结合Caspase 3并抑制其活化，从而阻断GSDME介导的焦亡。该发现为急性痛风的自我限制现象提供了新的分子解释，为靶向AAT-Caspase 3/GSDME轴的治疗策略奠定了理论基础。

　　

痛风是一种由单钠尿酸盐（MSU）晶体沉积引起的炎症性关节炎，患者关节常出现红、肿、痛等典型症状。令人惊奇的是，急性痛风发作通常会在7-10天内自行缓解，这一现象被称为痛风性关节炎的自发缓解。然而，其背后的分子机制至今仍未完全阐明。巨噬细胞在MSU晶体诱导的滑膜炎中扮演着双重角色，既参与炎症的启动与推进，也参与炎症的消退。焦亡（pyroptosis）是一种程序性细胞死亡方式，由Gasdermin家族蛋白执行，其通过在细胞膜上形成孔洞，导致细胞渗透性改变、裂解，并释放乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎分子。目前，痛风相关焦亡研究主要集中于NLRP3/Caspase 1/Gasdermin D（GSDMD）轴，而其他Gasdermin蛋白是否参与MSU晶体诱导的巨噬细胞焦亡尚不清楚。

为此，研究人员开展了本项研究，旨在探究Caspase 3/Gasdermin E（GSDME）轴是否参与MSU晶体诱导的巨噬细胞焦亡，并深入探索Caspase 3相互作用蛋白——α1-抗胰蛋白酶（AAT）在急性痛风中的表达特征及其在调控巨噬细胞焦亡中的作用。

研究团队运用了多种关键技术方法：收集了健康对照、间歇期和急性期痛风患者的血清、外周血单核细胞（PBMCs）及膝关节滑液样本进行临床指标检测；利用人单核细胞系THP-1诱导分化的巨噬细胞进行体外MSU晶体刺激实验；通过小干扰RNA（siRNA）敲低基因表达；采用转录组测序（RNA-Seq）筛选差异表达基因；通过免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析（IP-MS）鉴定蛋白质相互作用；利用免疫荧光、蛋白质印迹（Western blotting）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术进行蛋白表达和定位分析；并建立了MSU晶体诱导的小鼠急性痛风性关节炎模型进行体内功能验证。

GSDME在急性痛风患者PBMCs和滑膜巨噬细胞中表达升高

临床样本分析显示，与健康对照和间歇期痛风患者相比，急性痛风患者PBMCs中GSDME和IL1B的mRNA表达水平显著升高。GSDME mRNA表达与IL1B呈正相关。对膝关节滑液细胞的免疫荧光染色发现，GSDME在痛风患者滑膜巨噬细胞（CD68+）中的表达高于骨关节炎（OA）患者，而在滑膜成纤维细胞（Vimentin+）中无差异，表明滑膜巨噬细胞是GSDME差异表达的主要细胞来源。

MSU晶体通过激活的Caspase 3切割GSDME诱导巨噬细胞焦亡

在THP-1来源的巨噬细胞中，MSU晶体刺激后，GSDME和CASP3的mRNA表达上调，活化的Caspase 3（cleaved Caspase 3）和GSDME-N端片段（GSDME-N）的蛋白表达也增加。使用Caspase 3抑制剂Z-DEVD-FMK预处理或利用siRNA敲低Caspase 3表达，均能显著抑制MSU晶体诱导的IL-1β和LDH释放，改善细胞活力，减少焦亡细胞比例。同样，敲低GSDME也能减弱GSDME-N的生成和细胞焦亡。免疫共沉淀实验证实了Caspase 3与GSDME之间存在相互作用。

Caspase 3抑制剂Z-DEVD-FMK缓解小鼠急性痛风性关节炎

在MSU晶体诱导的小鼠急性痛风性关节炎模型中，腹腔注射Z-DEVD-FMK能显著减轻足爪肿胀，降低局部组织IL-1β水平，并减少足爪组织中CD68+巨噬细胞的GSDME表达。

鉴定Caspase 3相互作用蛋白AAT及其在急性痛风中的表达特征

通过免疫共沉淀结合质谱分析（IP-MS），在MSU晶体诱导的巨噬细胞中鉴定出AAT是Caspase 3的相互作用蛋白。临床样本检测发现，急性痛风患者血清AAT水平、PBMCs中SERPINA1（编码AAT的基因）mRNA表达、以及膝关节滑液中AAT浓度均显著高于健康对照或间歇期患者。免疫荧光显示，滑液AAT的升高主要来源于CD68+滑膜巨噬细胞。体外实验中，MSU晶体刺激也能上调THP-1来源巨噬细胞的SERPINA1 mRNA、细胞内AAT蛋白及上清液中AAT浓度。

AAT通过结合Caspase 3抑制GSDME依赖性焦亡

在THP-1来源的巨噬细胞中，外源性添加AAT能被细胞内化，并显著抑制MSU晶体诱导的IL-1β和LDH释放，提升细胞存活率，减少焦亡细胞，同时降低cleaved Caspase 3和GSDME-N的蛋白水平。免疫共沉淀证实，内化的AAT能与Caspase 3直接结合，并且AAT预处理削弱了Caspase 3与GSDME之间的相互作用。在动物模型中，足垫局部注射AAT能有效减轻MSU晶体引起的小鼠足爪肿胀和局部IL-1β产生，并降低足爪组织中CD68+巨噬细胞的GSDME表达。

LRP1与AAT结合并负责其内化至MSU晶体诱导的巨噬细胞

急性痛风患者PBMCs中LRP1的mRNA表达升高。在THP-1来源的巨噬细胞中，敲低LRP1会显著减弱Elab Fluor? 488标记的AAT的内化荧光强度。免疫共沉淀显示AAT与LRP1存在相互作用。更重要的是，在LRP1敲低的细胞中，AAT对MSU晶体诱导的焦亡（IL-1β释放、LDH释放和细胞活力）的保护作用被显著削弱。

本研究首次揭示了Caspase 3/GSDME依赖性焦亡通路在急性痛风患者巨噬细胞中的激活。研究结果表明，急性痛风发作时，滑膜巨噬细胞分泌大量AAT，导致滑液中AAT水平升高。升高的AAT通过巨噬细胞表面的LRP1受体被内化至细胞内，进而通过直接结合Caspase 3，抑制其活化及后续对GSDME的切割，最终减轻巨噬细胞焦亡和炎症反应。AAT的这种细胞内抗焦亡作用为急性痛风的自发缓解现象提供了新的分子机制解释。靶向AAT-Caspase 3/GSDME轴可能成为治疗急性痛风的一种潜在新策略。然而，AAT在痛风不同阶段可能发挥的复杂作用、其对巨噬细胞不同亚群功能的特异性影响、以及炎症微环境调控LRP1表达和AAT内化的具体机制，仍有待未来更深入的研究。