CD36通过激活Hippo-YAP信号通路介导的失巢凋亡抵抗驱动乳腺癌淋巴结转移的机制研究

《Communications Biology》：Elevated CD36 drives lymph node metastasis of breast cancer by activating Hippo-YAP signaling-mediated anoikis resistance

本研究针对乳腺癌淋巴结转移机制不清的难题，发现脂肪酸转运蛋白CD36在淋巴脂质富集微环境中通过PPARα-CYP7A1胆汁酸合成通路激活Hippo-YAP信号，进而上调Bcl-2表达诱导失巢凋亡抵抗，最终促进淋巴结转移。该研究为乳腺癌转移防治提供了新的代谢干预靶点。

　　

在全球女性恶性肿瘤中，乳腺癌不仅发病率高居首位（占11.6%），其导致的死亡率也相当可观（6.9%）。多数乳腺癌患者的死亡并非原发肿瘤本身所致，而是源于肿瘤细胞的远处转移。在多种转移途径中，淋巴结转移尤为常见，它像是癌细胞向更远处扩散的"跳板"，尤其多见于Luminal型乳腺癌，而非三阴性乳腺癌。淋巴结转移状况是评估患者预后和远处转移风险的关键指标，阳性淋巴结数量与远处转移风险密切相关。然而，与对远处转移机制的大量研究相比，人们对癌细胞如何在淋巴系统中生存和生长的认识仍显不足，这限制了对乳腺癌淋巴结转移的有效防治。

淋巴系统一个显著的特点是富含脂质成分。研究人员通过在大鼠肠系膜淋巴管插管模型中发现，淋巴液中甘油三酯和游离脂肪酸含量丰富。这一特征提示，脂质代谢可能在乳腺癌淋巴结转移中扮演重要角色。基于这一假设，研究团队利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行生物信息学筛选，发现脂肪酸转运通路与乳腺癌淋巴结转移分期（N分期）显著相关。在众多脂肪酸受体中，CD36（分化簇36）与N分期的相关性最强，提示CD36可能是调控乳腺癌淋巴结转移的关键分子。

CD36是一种多功能糖蛋白，可作为脂肪酸、氧化低密度脂蛋白等多种配体的受体，在脂质稳态、动脉粥样硬化、血管生成和肿瘤发生中发挥重要作用。然而，CD36在乳腺癌淋巴结转移中的具体功能及其机制尚不清楚。

为了验证CD36的临床意义，研究人员收集了157例乳腺癌临床标本进行免疫组织化学染色分析。结果发现，CD36在乳腺癌组织中的表达显著高于正常和癌旁组织。更重要的是，CD36的高表达与淋巴结转移分期、阳性淋巴结数量、远处转移发生以及肿瘤临床分期呈正相关。生存分析显示，CD36高表达患者的无进展生存期和总生存期均显著短于低表达患者。这些结果证实CD36的异常高表达与乳腺癌淋巴结转移和不良预后密切相关。

进一步分析发现，CD36在不同分子亚型乳腺癌中的表达存在差异：Luminal型乳腺癌细胞系（如T-47D）的CD36表达水平高于三阴性乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231）。这一发现与临床观察一致——Luminal型乳腺癌的淋巴结转移率通常高于三阴性乳腺癌。单细胞RNA测序分析也显示，在淋巴结转移阳性病例的Luminal上皮细胞和前体细胞中，CD36表达显著高于转移阴性病例。

为了在体内验证CD36的功能，研究团队建立了两种小鼠模型：腘窝淋巴结转移模型和原位乳腺脂肪垫模型。在腘窝淋巴结转移模型中，过表达CD36的MDA-MB-231细胞（231-CD36）接种到裸鼠脚垫后，腘窝淋巴结中的转移癌细胞数量显著增加，淋巴结体积和重量也明显增大。相反，敲低CD36的T-47D细胞（T-47D-shCD36）则显著降低了淋巴结转移的发生率。在原位模型中，过表达Cd36的4T1细胞（4T1-Cd36）也显著增强了腹股沟淋巴结的转移。这些体内实验证实CD36确实能够促进乳腺癌的淋巴结转移。

接下来，研究人员深入探索了CD36促进淋巴结转移的机制。考虑到淋巴系统的脂质富集特性，他们首先测试了不同CD36表达水平的乳腺癌细胞在淋巴环境中的适应性。结果显示，在淋巴或棕榈酸（PA）处理条件下，CD36高表达的T-47D细胞能更好地维持线粒体膜电位和细胞状态，而CD36缺失的MDA-MB-231细胞则出现明显的线粒体膜电位下降和细胞凋亡。由于悬浮在循环系统中的肿瘤细胞容易发生失巢凋亡（一种因脱离细胞外基质而发生的特殊程序性死亡），研究人员推测CD36可能通过诱导失巢凋亡抵抗来促进癌细胞在淋巴系统中的存活。

通过超低吸附板模拟悬浮培养环境，研究证实CD36确实能增强乳腺癌细胞在棕榈酸条件下的存活能力并抵抗失巢凋亡。软琼脂实验也显示CD36促进了乳腺癌细胞的锚定非依赖性生长。这些结果共同表明CD36赋予了乳腺癌细胞失巢凋亡抵抗能力。

失巢凋亡主要依赖于线粒体凋亡或死亡受体凋亡通路。基因集变异分析（GSVA）显示，CD36表达水平与多种线粒体凋亡通路呈显著负相关。实验证实，CD36过表达能稳定维持线粒体膜电位，减少细胞色素C（Cyto-C）从线粒体向胞质的释放，并降低剪切型Caspase 9的水平。相反，敲低CD36则产生相反效果。进一步研究发现，CD36特异性地上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白水平，而对Bcl-2家族其他成员影响不大。

机制上，研究人员发现CD36与Hippo-YAP信号通路密切相关。临床标本免疫组化显示CD36表达与YAP呈正相关。在动物模型中，CD36过表达也增加了YAP的表达。细胞实验表明，CD36通过抑制YAP在Ser127位点的磷酸化，减少其泛素化降解，促进YAP核转位和激活，而不影响YAP的mRNA水平。YAP-TEADs复合物的激活是这一过程的关键环节。

为了验证YAP在CD36功能中的必要性，研究人员进行了挽救实验。在腘窝淋巴结转移模型中，敲低YAP1显著减弱了CD36过表达引起的淋巴结转移增加。细胞实验也显示，抑制YAP-TEADs结合（使用抑制剂Verteporfin）或敲低YAP1，都能逆转CD36诱导的失巢凋亡抵抗和线粒体膜电位维持能力。这些结果证明CD36确实是通过YAP-TEADs通路发挥作用的。

进一步机制探索发现，YAP-TEADs复合物能直接结合到BCL2基因启动子区，上调Bcl-2转录。荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实了YAP与BCL2启动子的直接结合，并鉴定出了特异性结合位点。

脂质代谢物在YAP信号调控中起着重要作用。转录组和代谢组分析显示，CD36表达与胆固醇和胆汁酸代谢通路及其代谢物呈正相关。动物实验发现，CD36过表达增加了肿瘤组织中的胆固醇、胆汁酸和游离脂肪酸水平。CD36通过促进脂肪酸摄取，上调了PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）及其下游的CYP7A1（胆固醇7α-羟化酶，胆汁酸合成的限速酶）和HMGCR（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，胆固醇合成的关键酶）的表达。使用PPARα抑制剂GW6471或胆汁酸抑制剂奥贝胆酸，都能抑制CD36诱导的YAP核转位和激活。这表明CD36是通过PPARα-CYP7A1-胆汁酸合成通路来激活YAP信号的。

本研究主要运用了以下关键技术方法：基于TCGA、SEER等公共数据库的生物信息学分析；157例临床乳腺癌标本的免疫组织化学染色和统计分析；小鼠腘窝淋巴结转移模型和原位乳腺脂肪垫模型；活细胞成像、线粒体膜电位检测、流式细胞术等细胞功能实验；蛋白质印迹、核质分离等分子生物学技术；荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀等转录调控研究；以及脂质成分检测等代谢分析。

研究结果可归纳为以下几个主要方面：

1. 1.
   CD36表达与乳腺癌淋巴结转移和预后不良相关：临床样本分析显示CD36高表达与淋巴结转移分期、阳性淋巴结数量、远处转移和肿瘤分期正相关，且患者预后更差。
2. 2.
   CD36促进乳腺癌淋巴结转移：体内小鼠模型证实CD36过表达增强淋巴结转移，而敲低CD36则抑制转移。
3. 3.
   CD36诱导失巢凋亡抵抗：CD36高表达乳腺癌细胞在淋巴或棕榈酸环境中能抵抗失巢凋亡，维持细胞存活。
4. 4.
   CD36抑制线粒体凋亡：CD36通过上调Bcl-2表达，抑制细胞色素C释放和Caspase 9激活，减轻线粒体凋亡。
5. 5.
   CD36激活Hippo-YAP信号：CD36抑制YAP Ser127磷酸化，减少其泛素化降解，促进YAP核转位和转录活性。
6. 6.
   YAP-TEADs介导CD36的功能：YAP敲低或TEADs结合抑制可逆转CD36促转移和抗凋亡效应。
7. 7.
   YAP-TEADs直接转录调控BCL2：YAP-TEADs复合物直接结合BCL2启动子特定区域，上调其表达。
8. 8.
   CD36通过PPARα-CYP7A1-胆汁酸通路激活YAP：CD36促进脂肪酸摄取，上调PPARα-CYP7A1信号，增加胆汁酸合成，进而激活YAP。

本研究揭示了CD36在乳腺癌淋巴结转移中的关键作用及其分子机制。不同于既往研究主要关注CD36在脂肪酸代谢方面的功能，本研究发现了CD36一条新的信号通路：通过PPARα-CYP7A1-胆汁酸合成轴激活Hippo-YAP信号，进而上调Bcl-2表达，诱导失巢凋亡抵抗，最终促进淋巴结转移。这一发现不仅深化了对乳腺癌淋巴结转移机制的理解，强调了脂质代谢在转移过程中的重要性，还为乳腺癌转移的防治提供了新的潜在靶点。由于全身性抑制CD36或YAP可能产生严重副作用，针对PPARα和CYP7A1的干预策略可能具有更好的临床应用前景。该研究发表于《Communications Biology》期刊，为乳腺癌转移的代谢干预策略提供了重要的理论依据。