LRRK2 P1446L突变通过DAPK1介导的神经炎症与细胞凋亡驱动帕金森病神经退行性变

《npj Parkinson's Disease》：The LRRK2 P1446L mutation triggers dopaminergic neurodegeneration via DAPK1-mediated microglial neuroinflammation and neuronal apoptosis

本研究针对新型LRRK2-P1446L突变在帕金森病(PD)中的致病机制不明确的问题，通过构建基因编辑小鼠模型，首次揭示该突变通过下调LRRK2并上调死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)，同时激活小胶质细胞PI3K/Akt/NF-κB通路介导神经炎症和神经元线粒体凋亡通路，导致多巴胺能神经元退行性变。多组学分析发现神经保护分子tuftsin下调与DAPK1表达呈负相关，且与肠道菌群改变相关，为LRRK2相关PD提供了新的治疗靶点。

　　

帕金森病作为全球第二大神经退行性疾病，其病理特征主要表现为中脑黑质多巴胺能神经元的进行性丢失以及α-突触核蛋白(α-synuclein)的异常聚集。尽管遗传因素在帕金森病发病中起着关键作用，其中富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)的突变已被证实是家族性帕金森病最常见的遗传原因之一，但不同位点突变的具体致病机制仍存在显著差异。尤其值得注意的是，位于LRRK2基因ROC结构域的新型错义突变P1446L虽在临床队列中被发现与帕金森综合征相关，但其是否直接驱动神经退行性变、通过何种分子效应器协调神经元死亡与神经炎症、以及是否引发黑质纹状体轴以外的多系统病理改变，这三个核心科学问题至今尚未得到解答。

为了深入探究LRRK2-P1446L突变的致病机制，研究人员在《npj Parkinson's Disease》上发表了最新研究成果。该研究首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了LRRK2-P1446L点突变敲入小鼠模型，通过整合行为学评估、神经病理学分析、转录组学、蛋白组学、脑代谢组学以及肠道微生物组测序等多层次技术手段，系统阐明了该突变通过死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)这一关键枢纽分子协调小胶质细胞介导的神经炎症和神经元凋亡的双重细胞毒性过程。

研究采用的主要关键技术方法包括：CRISPR/Cas9基因编辑构建LRRK2-P1446L点突变小鼠模型；行为学测试（旷场、转棒、悬尾等）评估运动与非运动功能；免疫印迹和免疫荧光检测蛋白表达与定位；细胞模型（MN9D多巴胺能神经元系和BV2小胶质细胞系）验证分子机制；转录组测序分析差异基因表达；代谢组学分析脑内代谢物变化；16S rRNA测序分析肠道菌群组成。

研究结果

LRRK2-P1446L突变诱导年龄依赖性帕金森样表型伴多巴胺能退行性变和α-突触核蛋白病理

行为学测试显示突变小鼠出现进行性运动障碍（总移动距离减少、运动速度下降）和焦虑/抑郁样行为。神经病理分析发现8、12和16月龄突变小鼠黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)蛋白水平显著降低，同时磷酸化α-突触核蛋白(p-α-syn)水平随年龄增长而积累，证实该突变导致年龄渐进性的多巴胺能神经元退行性变和α-突触核蛋白病理。

转录组谱分析鉴定黑质中DAPK1上调和相关神经炎症通路

黑质组织转录组分析鉴定出283个上调基因和433个下调基因，其中Dapk1表达显著上调约2.5倍。生物信息学分析提示转录因子Sox10下调可能通过去抑制机制导致Dapk1转录增加。KEGG和GSEA富集分析显示PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路和免疫反应通路显著富集，提示DAPK1上调与神经炎症和凋亡信号通路密切相关。

DAPK1上调直接驱动多巴胺能神经元凋亡

蛋白水平验证显示突变小鼠黑质中LRRK2表达下调，而促凋亡蛋白DAPK1和Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。免疫荧光证实DAPK1在TH阳性多巴胺能神经元中表达增加。体外实验进一步表明LRRK2-P1446L突变可导致线粒体超氧化物水平升高和TUNEL阳性细胞增加，证实突变诱导神经元凋亡。

小胶质细胞中DAPK1激活通过PI3K-AKT/NF-κB信号级联触发神经炎症

研究发现DAPK1在Iba1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞中表达均增加。突变小鼠黑质中p-AKT、p-IκB和p-NF-κB p65蛋白水平升高，表明PI3K-AKT/NF-κB通路激活。免疫荧光显示p-p65信号特异性在小胶质细胞中增强，同时小胶质细胞呈现活化形态（胞体面积增大、分支减少）和吞噬标志CD68表达增加。qPCR检测发现促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平上调。

脑代谢组学揭示Tuftsin缺乏及其与DAPK1上调的负相关

代谢组学分析发现神经保护性四肽tuftsin在突变小鼠脑中显著下调，且与Dapk1转录水平呈显著负相关。分子对接模拟预测tuftsin与DAPK1具有强结合亲和力，提示两者可能存在直接相互作用。KEGG富集分析提示tuftsin耗竭与"轴突再生"通路抑制相关。

LRRK2-P1446L小鼠肠道菌群失调与功能通路改变和脑Tuftsin水平降低相关

16S rRNA测序显示突变小鼠肠道微生物群落结构发生显著改变。功能预测分析(PICRUSt2)显示与神经退行性疾病和衰老相关的微生物代谢通路发生改变。相关性分析发现tuftsin丰度与细菌属Paraprevotella丰度显著相关，提示潜在的"微生物组-tuftsin-脑"轴联系。

研究结论表明，LRRK2-P1446L突变通过下调LRRK2和上调DAPK1，协同触发小胶质细胞神经炎症（由PI3K/AKT/NF-κB通路介导）和神经元凋亡（由Bax/Bcl-2失衡介导），这一过程发生在tuftsin缺乏和肠道菌群失调的背景下。该研究有三项开创性贡献：确立DAPK1作为LRRK2相关帕金森病发病机制中的统一效应器，解释了突变位点依赖性异质性；鉴定tuftsin耗竭作为与DAPK1表达负相关的新代谢标志物；揭示了肠-脑轴在疾病中的潜在作用。这些发现提示抑制DAPK1表达、恢复tuftsin表达以及调节微生物组可能是治疗LRRK2-P1446L相关帕金森病的精准治疗策略，为靶向神经免疫活动与凋亡在神经退行性变中的协同作用提供了新框架。