胰腺癌分子分型平台差异研究：外显子捕获RNA测序与全转录组测序的PurIST分型比较揭示临床决策风险

《npj Precision Oncology》：Cross-platform comparison of gene expression-based cancer molecular subtyping reveals discrepancies with exome capture methods

本研究针对基因表达谱分析在精准肿瘤学中跨平台有效性不确定的问题，开展了胰腺导管腺癌(PDAC)分子分型算法PurIST在不同平台（全转录组RNA-seq、外显子捕获RNA-seq及NanoString nCounter?）的性能比较。研究发现，相较于全转录组“金标准”，外显子捕获方法会高估基底样(basal-like)亚型比例（一致性81%，Kappa=0.402），并削弱其与总生存期(OS)的显著关联（外显子捕获log-rank P=0.061 vs 全转录组P<0.0001），而NanoString平台则表现出高度一致性（95%）。该结果警示，未经充分验证的平台应用PurIST可能误导PDAC患者的治疗决策，凸显了临床转化前进行严格跨平台验证的必要性。

　　

胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌(PDAC)，以其极低的生存率著称，是医学界面临的重大挑战。近年来，精准肿瘤学的发展为改善患者预后带来了希望，其中，基于基因表达特征的分子分型扮演着越来越重要的角色。对于PDAC而言，PurIST (Purity Independent Subtyping of Tumors) 算法能够将肿瘤分为基底样(basal-like)和经典型(classical)两种主要亚型，这不仅具有预后意义——基底样亚型患者总生存期通常更短，更重要的是具有预测价值，指导着化疗方案的选择：经典型肿瘤对FOLFIRINOX方案更敏感，而基底样肿瘤可能从吉西他滨联合白蛋白紫杉醇(GnP)或联合表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂中获益更多。随着PurIST被整合进一些商业化的临床基因组学检测平台（如Tempus公司的xT/xR检测，使用外显子捕获RNA测序技术）并用于指导临床试验，一个关键问题浮出水面：这些在不同技术平台上运行的分子分型结果，能否与算法最初开发所基于的“金标准”方法（如全转录组RNA测序）保持一致？此前，在其他生物标志物如同源重组缺陷(HRD)和肿瘤突变负荷(TMB)的检测中，已有平台间结果不一致的报道，这直接影响了像PARP抑制剂使用这样的治疗决策。因此，迫切需要对PurIST在不同基因表达分析平台上的表现进行头对头的直接比较，以评估其临床应用的可信度。

为了回答上述问题，研究人员开展了一项跨平台比较研究。他们主要利用了两个队列的匹配样本：一个回顾性队列，包含79例PDAC患者，其肿瘤样本同时进行了全转录组RNA-seq和Tempus外显子捕获RNA-seq分析；另一个是来自前瞻性PANCREAS试验(NCT04683315)的40例患者队列，其样本同时进行了全转录组RNA-seq和已在临床实验室改进修正案(CLIA)认证实验室中用于临床试验的NanoString nCounter? PurIST检测。研究核心是比较不同平台间PurIST亚型呼叫（分类）的一致性、基底样概率的差异，并评估不同平台分型结果与患者临床结局（如总生存期OS和无进展生存期PFS）的关联强度。数据分析涉及一致性统计（如Cohen‘s kappa）、生存分析（Kaplan-Meier曲线和Cox回归）以及基因表达水平的比较。

PurIST使用外显子捕获RNA-seq与全转录组RNA-seq相比高估了基底样亚型的流行率

研究人员首先比较了回顾性队列中79对匹配样本的PurIST分型结果。以全转录组RNA-seq为参考标准，有7例(8.9%)肿瘤被分为基底样，72例(91.1%)为经典型。然而，使用外显子捕获RNA-seq时，基底样亚型增至22例(27.8%)，经典型降至57例(72.2%)。所有15例不一致的样本在用全转录组检测时均为经典型，但用外显子捕获时却被归类为基底样。总体一致性为81.0%，Cohen‘s kappa系数为0.402，仅表明中等程度的一致性。统计分析显示，外显子捕获法呼叫基底样的倾向存在显著偏差。进一步分析连续变量——基底样概率（即“基底特性”程度）发现，外显子捕获法得出的基底样概率显著高于全转录组法，且这种高估在基底样概率较低的样本中更为明显。通过ESTIMATE和DECODER两种生物信息学方法推断的肿瘤纯度与概率差异无显著相关性，表明分型不一致并非由样本肿瘤细胞含量低所致。

外显子捕获RNA-seq导致基因对表达比值的偏移

PurIST算法的核心是基于8对顶级评分基因对(TSP)的表达比值。研究人员深入探究了分型不一致的机制，发现外显子捕获导致多个TSP的比值从倾向于经典型转变为倾向于基底样。其中，KRT6A-ANXA10、BCAR3-GATA6和ITGA3-LGALS4这三对基因的转换尤为频繁。有意思的是，并非外显子捕获选择性增强了基底样基因的检测；相反，与外显组捕获相比，16个TSP基因中有14个在外显子捕获中的相对表达量降低，提示PurIST相关基因在外显子捕获中整体捕获效率可能不足。具体到易转换的TSP，基底样基因(KRT6A, BCAR3, ITGA3)在两个平台间的表达排名相对稳定，但其对应的经典型基因(ANXA10, GATA6, LGALS4)在外显子捕获中的表达相对更低，从而导致比值偏向基底样。

与外显子捕获得到的PurIST亚型相比，全转录组得到的亚型对总生存期的预后判断能力更强

分型差异是否具有临床意义？生存分析给出了答案。基于全转录组的分型，基底样亚型患者的中位OS（12个月）显著短于经典型患者（33个月），风险比(HR)为6.13。而基于外显子捕获的分型，虽然基底样亚型患者的中位OS（22个月）也短于经典型（35个月），但差异未达到统计学显著性，HR降至1.73。统计模型比较显示，全转录组亚型对OS的解释能力显著优于外显子捕获亚型。在无进展生存期(PFS)方面，两种方法都显示基底样亚型与较短的PFS相关，但关联强度不同。

NanoString nCounter?平台与全转录组的分型一致性更高

在PANCREAS试验队列的40对样本中，NanoString平台与全转录组RNA-seq的PurIST分型表现出高度一致性，准确率达95%，Cohen‘s kappa系数为0.722，表明具有高度一致性。配对的基底样概率在两个平台间无显著差异。此外，分型不一致也与肿瘤纯度无关，进一步支持了PurIST在低细胞含量样本中的稳健性。

本研究通过严谨的跨平台比较，揭示了将基于基因表达的比较性分类器（如PurIST）应用于不同技术平台时可能存在的风险。主要结论是，商业外显子捕获RNA测序方法会导致PurIST分型系统性偏向基底样亚型，从而削弱其预后价值，这可能对依赖该分型结果进行临床试验分配和治疗决策（如选择FOLFIRINOX还是GnP方案）产生重大影响。相比之下，NanoString平台与全转录组标准高度一致，更适合当前的临床研究应用。研究结果强调，实验室开发测试(LDT)在整合进商业平台并用于临床决策之前，必须进行严格的、基于匹配样本的头对头分析和临床验证。对于外显子捕获平台，可能需要重新筛选稳定的基因对、重新训练模型或调整分类阈值来改善一致性，且这些调整可能需要针对不同平台特异性进行。本研究为精准肿瘤学领域敲响了警钟：技术平台的差异绝非小事，它可能直接左右患者的治疗选择和生存结局。在追求诊疗便利化的同时，确保生物标志物检测结果的准确性和可靠性是不可逾越的底线。该研究发表于《npj Precision Oncology》，为PDAC的分子分型临床应用提供了关键的质量控制依据。