TTBK2激酶结构域错义变异导致功能丧失与磷酸化受损的机制研究

《Scientific Reports》：Missense variant in TTBK2 kinase domain causes loss of function and impaired protein phosphorylation

本研究针对TTBK2基因激酶结构域错义变异（L209F）的致病机制不明确问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建细胞模型，发现该变异导致TTBK2蛋白稳定性降低、激酶活性受损（尤其对TDP-43磷酸化能力减弱），并引发细胞骨架稳定性异常及TGF-β信号通路紊乱。该研究为脊髓小脑共济失调11型（SCA11）的致病机制提供了新见解，强调了激酶结构域错义变异的潜在致病性。

　　

在神经科学领域，tau微管蛋白激酶2（TTBK2）作为一种广泛表达的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，参与调控微管动力学、纤毛发生、突触信号传导等关键细胞过程。尤其值得注意的是，TTBK2能够磷酸化TAR DNA结合蛋白43（TDP-43），后者在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD-TDP）的病理蛋白聚集过程中扮演重要角色。然而，尽管TTBK2基因的截短变异已被明确证实会导致常染色体显性遗传病——脊髓小脑共济失调11型（SCA11），但位于激酶结构域内的错义变异是否具有致病性、其分子机制如何，至今仍是未解之谜。SCA11是一种罕见的进行性神经系统疾病，患者主要表现为小脑性共济失调、构音障碍、吞咽困难等症状，目前对其致病机制的理解尚不充分，尤其缺乏对错义变异功能的深入探索。

为了解决这一科学问题，由Daniela Felicio、Mariana Santos等研究人员组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们聚焦于在一个葡萄牙共济失调家族中发现的新型TTBK2错义变异（c.625C>T, p.Leu209Phe，简称L209F），该变异位于高度保守的激酶结构域内部。为了深入探究其功能性影响，研究团队巧妙地运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，在HEK293T细胞中成功构建了内源性表达3xFLAG标签的TTBK2-WT（野生型）和TTBK2-L209F（突变型）纯合敲入细胞模型。此外，研究还采用了生物信息学分析、蛋白质印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（qPCR）、磷酸化蛋白质组学（通过液相色谱-串联质谱LC-MS/MS实现）以及细胞功能分析（如细胞活力、蛋白酶体活性、自噬流检测）等一系列关键技术方法。值得一提的是，研究中分析的变异来源于一个葡萄牙家系的临床鉴定。

TTBK2-L209F影响蛋白表达

研究人员首先通过蛋白质印迹分析发现，与野生型细胞相比，TTBK2-L209F细胞中的TTBK2蛋白水平显著降低了约60%，而其mRNA水平并未发生明显变化。这表明L209F变异并非影响转录或mRNA稳定性，而是导致了TTBK2蛋白本身的稳定性下降，这一结果与生物信息学工具（DynaMut2）预测的该变异会 destabilizing）蛋白结构的结论相一致。进一步的研究排除了该变异引发细胞凋亡或影响TTBK2蛋白亚细胞定位的可能性。

TTBK2-L209F影响微管稳定性

由于TTBK2已知参与微管调节，团队检测了微管稳定性的标志物——乙酰化α-微管蛋白的水平。结果显示，在TTBK2-L209F细胞中，乙酰化α-微管蛋白的水平显著降低，同时，负责微管去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的蛋白表达量却近乎翻倍。此外，微管解聚蛋白KIF2A的蛋白水平也显著下降，尽管其mRNA水平不变。这些发现强烈提示，TTBK2-L209F变异导致了细胞骨架，特别是微管稳定性的失调。

TTBK2-L209F损害对TDP-43的激酶活性

TDP-43是TTBK2的已知底物。研究人员通过检测TDP-43在Ser409/410位点的磷酸化水平来评估TTBK2-L209F的激酶活性。结果表明，突变型细胞中磷酸化TDP-43（pTDP-43）的水平显著低于野生型细胞。过表达实验进一步证实，野生型TTBK2能增强pTDP-43水平，而过表达TTBK2-L209F则无此效果，与激酶失活突变体的表现类似。这直接证明了L209F变异损害了TTBK2对其底物TDP-43的磷酸化能力。

TTBK2-L209F与异常的蛋白质磷酸化相关

为了全面评估L209F变异对细胞磷酸化状态的广泛影响，研究团队进行了磷酸化蛋白质组学分析。他们鉴定出110个差异表达的磷酸化蛋白（DEPs），其中50个上调，60个下调。蛋白互作网络（PPI）分析揭示了这些蛋白在细胞信号传导、代谢、应激反应、细胞粘附、翻译等多个生物学过程中形成功能簇。特别值得注意的是，转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的关键蛋白SMAD2和SMAD4，以及自噬相关蛋白p62（SQSTM1）等均呈现上调。

磷酸化蛋白网络和功能富集分析

对差异磷酸化蛋白的功能富集分析（如过表征分析ORA和基因集富集分析GSEA）显示，在TTBK2-L209F细胞中，与胚胎发育、转录负调控、细胞应激反应等相关的通路被激活，而“细胞-细胞外基质相互作用”等通路则受到抑制。GSEA还提示细胞骨架调节、纤毛相关组分等通路富集，同时翻译和转录相关蛋白的磷酸化水平普遍下降。

TTBK2在转录和自噬中的潜在靶点

针对组学数据中凸显的转录和自噬/蛋白降解通路，研究人员进行了后续验证。他们证实SMAD2蛋白及其在Ser465/467位点的磷酸化水平在突变细胞中均显著升高，提示TGF-β信号通路可能被激活。自噬受体p62的蛋白水平也显著上调，同时自噬起始关键蛋白ULK1、beclin-1及其磷酸化形式（ULK1-Ser555, beclin-1-Ser93）的水平也有增加。然而，通过氯喹抑制自噬流的实验表明，LC3B-II的转化和p62的积累在野生型和突变型细胞中均能正常发生，说明基础自噬流并未被L209F变异阻断。部分自噬相关蛋白的mRNA水平也发生变化，表明其表达改变可能部分源于转录调控。

综上所述，本研究首次通过功能实验证实，TTBK2激酶结构域的错义变异L209F可通过“功能丧失”（loss of function）机制导致致病性。具体表现为：TTBK2蛋白稳定性降低、激酶活性受损（尤其对TDP-43磷酸化能力下降）、细胞骨架稳定性破坏，并引发广泛的磷酸化蛋白质组紊乱，涉及TGF-β信号传导、自噬、转录调控等多个关键细胞过程。这项研究不仅深化了对TTBK2生物学功能的理解，更重要的是为解读TTBK2基因错义变异（特别是位于激酶结构域内的变异）的致病潜力提供了坚实的实验依据，对SCA11以及其他可能与TTBK2功能障碍相关的神经系统疾病的机制研究和未来治疗策略开发具有重要意义。