ABOP优化策略：提升大颗粒回收率以推动高通量功能性细胞分选的新突破

《Scientific Reports》：Enhancing large particle recovery in high-throughput functional cell sorting through ΔBOP optimization

本文针对流式细胞术分选大颗粒（>30μm）时回收率低的技术瓶颈，通过计算流体动力学模拟和实验验证，揭示了振动驱动断裂点（vBOP）与颗粒诱导断裂点（pBOP）的相互干扰是导致液滴不稳定的关键机制。研究者提出ΔBOP（vBOP与pBOP时间差）优化策略，将35μm和50μm颗粒的回收率分别从72.2%和23.0%提升至92.4%和75.6%。该研究为单细胞分泌分析、抗体发现等活细胞功能研究提供了高效稳定的技术支撑。

　　

在生命科学领域，单细胞分析技术正以前所未有的分辨率揭示着细胞的异质性奥秘。随着空间转录组学和微流控技术的融合，科学家们已经能够绘制细胞在时间和空间维度上的行为图谱。然而，当研究焦点转向细胞功能——尤其是细胞分泌因子分析和细胞间通讯时，现有技术却面临着严峻挑战。传统的流式细胞术虽然具备高通量优势，但主要局限于检测结合在细胞表面的荧光标记分子，对于细胞分泌到环境中的蛋白质（如细胞因子）则无能为力。更棘手的是，许多功能研究需要在保持细胞活性的前提下进行，而当前能够实现这一目标的技术往往牺牲了通量效率。

这种技术矛盾在需要处理大颗粒样本时尤为突出。例如，科学家们开发出水凝胶微载体（如Nanovials）来捕获细胞及其分泌物，通过流式细胞术同时检测细胞和其分泌产物，为单细胞分泌分析带来了革命性突破。然而，商业流式细胞仪的喷嘴系统通常限制在130μm，这意味着可分选颗粒的直径最大只能达到约30μm。当尝试分选更大的颗粒（如35-50μm）时，回收率会急剧下降至40-60%，远低于淋巴细胞分选时90%以上的标准效率。尽管微流控技术能达到较高回收率，但其通量仅限于200-600 Hz，无法满足百万级细胞筛选的需求。这种"大颗粒分选困境"严重制约了抗体药物开发、CAR-T细胞疗法评估等关键领域的进展。

为了解决这一技术瓶颈，索尼公司的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们通过巧妙的实验设计和模拟计算，揭示了大颗粒分选回收率低下的根本机制，并提出了一个简单而有效的优化策略。

研究团队主要采用了计算流体动力学（CFD）模拟、高速摄像分析和流式细胞术实验验证相结合的技术路线。他们使用Star-CCM+软件进行了液滴形成过程的精细模拟，同时通过Sony SH800S和MA900流式细胞系统进行实验验证，样本包括30-50μm的荧光微球、35-50μm的Nanovials微载体以及HEPG2细胞来源的细胞球体。

粒子诱导断裂点（pBOP）的发现与验证

研究人员首先通过CFD模拟发现，在没有外部振动的情况下，液流的断裂长度（BOL）会随着颗粒尺寸的增大而显著缩短。20μm颗粒对周围流场影响很小，而35μm颗粒已经开始扰动液流，导致液滴更早断裂。对于50μm颗粒，这种效应更加明显——颗粒本身几乎主导了液滴的断裂过程。更重要的是，在没有颗粒的情况下，由于瑞利-普拉托不稳定性（Rayleigh-Plateau instability）的存在，液滴断裂点会出现高达3mm的随机波动，这解释了为什么传统分选系统在大颗粒分选时表现不稳定。

实验观察完美验证了模拟结果：随着颗粒尺寸从20μm增加到50μm，断裂点（BOP）位置系统地向上游移动。特别是35μm颗粒的断裂行为与标准压电分选条件下的观察高度一致，这提示我们颗粒自身会诱导产生一个独立的断裂点——研究者将其命名为颗粒诱导断裂点（pBOP）。

ΔBOP优化机制的提出

基于这些发现，研究团队提出了一个核心假设：振动驱动断裂点（vBOP）和颗粒诱导断裂点（pBOP）之间的干扰是导致回收率下降的关键原因。对于小颗粒（≤20μm），pBOP远在vBOP之下，两者互不干扰；但对于35μm颗粒，两个断裂点发生重叠，通过毛细波干涉破坏液滴形成的稳定性；50μm颗粒的情况更为复杂，pBOP甚至出现在vBOP之前，导致分选时序错位。

为了量化这种干扰，研究者引入了ΔBOP参数，定义为pBOP与vBOP之间的时间差。通过高速摄像分析证实，当ΔBOP值较小时，断裂点会出现不稳定的垂直波动，而增大ΔBOP能够显著提高液滴形成的稳定性。

35μm颗粒的分选优化

研究团队通过缩短vBOP来增大ΔBOP的策略，成功将35μm颗粒的回收率从72.2%提升至92.4%。高速摄像分析显示，优化后断裂点与激光检测点之间的距离标准差从0.50mm降低到0.21mm，变异系数（CV）从0.04改善到0.02，表明液滴形成稳定性得到显著提高。多设备验证实验（48个实验点）进一步确认，当ΔBOP超过0.4ms时，回收率能够稳定在80%以上，大多数情况下可达90%以上。

50μm颗粒的分选挑战与突破

对于更大的50μm颗粒，研究团队采用了更为激进的vBOP降低策略。尽管50μm颗粒的pBOP已经相对较高，但通过进一步增加ΔBOP的绝对值，仍然成功将回收率从23.0%提升至75.6%。虽然改善幅度不如35μm颗粒显著，但这一结果证明ΔBOP优化策略对不同尺寸颗粒都具有普适性。

生物样本验证

为了验证该策略在真实生物样本中的适用性，研究团队使用HEPG2细胞球体（直径约28.36μm）进行了测试。随着ΔBOP从0.25增加到0.75，球体回收率从66%提升至85%，证明该优化方法在保持细胞活性和功能的前提下，能够有效改善大尺寸生物颗粒的分选效率。

这项研究的创新之处在于首次明确揭示了颗粒自身对液滴断裂行为的影响机制，并提出了一个简单实用的参数化解决方案。ΔBOP概念的引入不仅为大颗粒分选提供了理论指导，更重要的是，它可以通过调整现有的流式细胞仪参数来实现，无需硬件改造即可显著提升性能。

该研究的实际意义深远。首先，它将流式细胞术的应用范围成功扩展至35-50μm的大颗粒分选，为基于微载体的单细胞功能分析提供了高效稳定的技术平台。研究人员现在可以更可靠地分选封装在微载体中的活细胞，进行抗体发现、细胞因子分泌谱分析等研究。其次，该方法保持了流式细胞术固有的高通量优势（最高70,000 Hz），解决了微流控技术通量不足的瓶颈，使得百万级B细胞筛选变得切实可行。

值得注意的是，这种优化策略具有广泛的适用性，不仅适用于水凝胶颗粒，还可用于双乳液、琼脂糖微球等多种载体系统。这种灵活性让研究人员能够根据具体应用需求选择最合适的载体类型，而不必担心分选效率的损失。

当然，该技术目前仍存在一些限制，例如对超过50μm颗粒的分选效果有待验证，大颗粒可能导致的管路堵塞问题也需要进一步解决。此外，对于颗粒尺寸分布较宽的样本，ΔBOP优化可能需要与颗粒预筛选技术结合使用。

总体而言，这项研究通过深入理解液滴形成物理学，提出了一个简单而强大的优化策略，成功解决了流式细胞术在大颗粒分选中的技术瓶颈。随着自动化大颗粒分选技术的实现，这一突破有望在免疫学、癌症研究和再生医学等多个领域加速科学发现和治疗创新，为单细胞功能分析开辟新的可能性。