滑膜肉瘤类器官模型的建立及其在低苹果酸酶1表达下展现铁死亡抵抗机制的研究

《Scientific Reports》：Development of synovial sarcoma organoids exhibiting ferroptosis resistance despite low malic enzyme 1 expression

本研究针对滑膜肉瘤(SS)缺乏有效治疗模型的难题，成功建立了三种患者来源的SS类器官(PDO)模型。这些模型通过气液界面(ALI)培养法构建，保留了原始肿瘤的组织学特征和SS18-SSX融合基因。意外发现，尽管SS类器官中苹果酸酶1(ME1)低表达（通常与铁死亡敏感性相关），它们却对铁死亡诱导剂erastin表现出抵抗性。这一发现揭示了SS中铁死亡调控的复杂性，为开发新的治疗策略提供了重要平台。该模型有望成为SS药物筛选和机制研究的宝贵临床前工具。

　　

滑膜肉瘤（Synovial Sarcoma, SS）是一种好发于青少年和年轻成人的恶性软组织肿瘤，虽然其分子特征——由染色体易位t(X;18)导致的SS18-SSX融合基因——已被阐明，但几十年来，患者的治疗方案仍以多柔比星为基础的化疗为主，缺乏突破性进展。究其原因，很大程度上在于缺乏能够精准模拟人体内肿瘤特性的研究模型。传统的二维细胞系和动物模型在预测临床疗效方面存在局限。因此，开发能够保留原始肿瘤生物学特性的新型模型，成为推动滑膜肉瘤治疗发展的迫切需求。

在此背景下，研究人员将目光投向了类器官（Organoid）技术。类器官是一种在体外培养的三维（3D）细胞团，能够模拟原始组织的结构和功能，近年来在多种癌症研究中展现出巨大潜力。然而，稳定、可用的滑膜肉瘤类器官模型的建立此前尚未见报道。为了解决这一瓶颈问题，并为进一步的药物筛选和机制研究提供可靠平台，本研究旨在利用改良的气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养方法，建立滑膜肉瘤患者来源的类器官模型，并深入评估其生物学特性以及对潜在治疗策略的反应。

本研究成功从5例滑膜肉瘤患者的手术标本中，建立了3株具有稳定传代能力的患者来源类器官（Patient-Derived Organoid, PDO）系，分别命名为OICI-SS-0891、OICI-SS-0935和OICI-SS-1253。这些类器官在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-scid IL2Rγ^null, NSG）小鼠体内成功形成了异种移植瘤（Organoid-Derived Xenograft, ODX），证明了其致瘤能力。重要的是，组织学分析、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、桑格测序（Sanger Sequencing）和蛋白质印迹法（Western Blotting）均证实，这些类器官及其衍生的ODX模型成功保留了原始肿瘤的关键特征，包括SS18-SSX融合基因（本研究中均为SS18-SSX1型）的表达。

转录组测序（RNA-Seq）分析进一步强化了类器官与原始肿瘤的相似性。聚类分析、相关性分析和主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）均显示，每个患者的原始肿瘤与其对应的ODX样本在基因表达谱上高度相似，聚集在同一簇中。功能富集分析发现，在肿瘤中高表达的基因显著富集于与干细胞特性相关的信号通路，如Wnt信号通路、Hippo信号通路等，这与滑膜肉瘤的干细胞特性假说相吻合。

基于近期有研究指出滑膜肉瘤细胞因缺乏苹果酸酶1（Malic Enzyme 1, ME1）的表达而对铁死亡（Ferroptosis）诱导剂高度敏感，研究人员对建立的类器官进行了相关验证。铁死亡是一种铁依赖性的、与脂质过氧化积累相关的程序性细胞死亡形式。与本研究的RNA-seq数据以及癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库中滑膜肉瘤的数据一致，所有建立的类器官均表现出低水平的ME1表达，并且伴随TP53表达的升高，这与已知的ME1与p53之间的相互调控关系一致。然而，出乎意料的是，当用铁死亡诱导剂erastin处理这些类器官时，无论是在ALI类器官培养条件、球体（Spheroid）培养条件还是贴壁（Adherent）培养条件下，类器官均表现出明显的抵抗性，仅出现轻微的活力下降。这与常规滑膜肉瘤细胞系（如Yamato-SS和Aska-SS）对erastin的敏感性形成了鲜明对比。

为了探究SS18-SSX融合基因在类器官生长中的作用，研究人员利用短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）技术敲低了融合基因的表达。结果显示，在OICI-SS-0935和OICI-SS-1253类器官中，敲低SS18-SSX能够适度抑制细胞增殖，尤其是在球体培养中效果更为明显；然而，在OICI-SS-0891中，增殖并未受到显著影响。这表明，在某些滑膜肉瘤类器官中，其生长并不完全依赖于SS18-SSX融合基因，提示可能存在异质性或获得性耐药机制。值得注意的是，OICI-SS-0891来源于一位经过多线治疗（包括多柔比星+异环磷酰胺、帕唑帕尼、临床试验药物、曲贝替定）的复发患者，其类器官增殖最慢，且对erastin的抵抗性最强，这暗示先前的治疗可能筛选出了不依赖融合基因且对铁死亡诱导剂不敏感的细胞亚群。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：从患者手术标本出发，利用改良的ALI培养体系建立和传代滑膜肉瘤类器官；将类器官移植至NSG小鼠体内构建PDX模型，以验证其体内成瘤能力；通过组织病理学（H&E染色）、免疫组织化学、RT-PCR、桑格测序和蛋白质印迹法进行分子表征；利用shRNA进行基因功能缺失研究；通过RNA-seq进行转录组学分析；并采用Cell Titer-Glo法等活力检测方法在不同培养条件下（类器官、球体、贴壁）进行药物敏感性测试。

结果

1. Establishment of three organoids from human patients with SS using the ALI organoid culture method

研究人员尝试对5例滑膜肉瘤患者标本进行ALI类器官培养，成功建立了3株类器官系（OICI-SS-0891, OICI-SS-0935, OICI-SS-1253）。这些类器官呈现稳定生长，形态为球形或伴有梭形细胞在周边增殖。将其移植到NSG小鼠后均能形成肿瘤，但成瘤时间有差异（OICI-SS-1253最快，2-3个月）。类器官在10天内的活力增长倍数也不同（OICI-SS-0891增长较慢）。研究表明，这些类器官模型能够通过PDX建立进行连续传代。

2. Morphologic characteristics of SS organoids

通过苏木精-伊红（H&E）染色对比发现，OICI-SS-0891和OICI-SS-0935的ODX模型较好地保留了原始肿瘤（病例1和2为单相型，病例3为双相型）的组织学特征。然而，来源于双相型肿瘤的OICI-SS-1253的ODX则表现为单相型模式，说明在类器官培养和异种移植过程中，其部分形态学特征发生了改变。

3. Some SS organoids required the fusion gene, SS18-SSX, for their proliferation

免疫组化、RT-PCR和测序结果一致证实，三类器官及其ODX均表达SS18-SSX1融合基因。蛋白质印迹分析也检测到了融合蛋白的表达。通过shRNA敲低SS18-SSX表达后，发现在OICI-SS-0935和OICI-SS-1253中，尤其是在球体培养条件下，细胞增殖受到抑制，但在OICI-SS-0891中无显著影响。这表明SS18-SSX融合基因对部分滑膜肉瘤类器官的增殖是必需的，但也存在不依赖该基因生长的细胞群体。

4. Transcriptome profiling in SS organoids

RNA-seq分析表明，原始肿瘤与其对应的ODX在基因表达谱上高度相似，聚类在一起。与正常组织相比，肿瘤中上调和下调的基因涉及多种通路，其中上调基因显著富集于干细胞多能性调控、Wnt、Hippo等信号通路。

5. SS organoids exhibited ferroptosis resistance despite low ME1 expression

尽管类器官中ME1表达水平低且TP53表达升高，与临床样本特征一致，但它们对铁死亡诱导剂erastin表现出抵抗性。这种抵抗性在不同培养条件下（类器官、球体、贴壁）均存在，与常规滑膜肉瘤细胞系的敏感性不同。

结论与讨论

本研究首次成功报道了利用改良ALI培养方法建立滑膜肉瘤患者来源类器官模型。这些模型不仅稳定传代，具有体内成瘤能力，更重要的是，它们在组织学、遗传学（SS18-SSX融合基因）和转录组层面高度模拟了原始肿瘤的特性，为滑膜肉瘤的研究提供了高度可靠的新型临床前模型。

最引人注目的发现是，尽管类器官具备理论上对铁死亡敏感的关键特征（低ME1表达），但它们却表现出对erastin的抵抗。这一出乎意料的结果揭示了滑膜肉瘤中铁死亡调控的复杂性，提示除ME1之外还存在其他抵抗机制。同时，类器官对SS18-SSX融合基因依赖性的差异，以及其药物反应性与常规细胞系的不同，凸显了患者来源类器官模型在捕捉肿瘤异质性和临床相关性方面的独特优势。先前的治疗史可能影响了类器官的生物学特性，例如OICI-SS-0891所表现出的缓慢增殖和对治疗的低反应性，可能反映了临床耐药性的演变。

尽管ALI培养法在实现高通量药物筛方面存在挑战，但本研究观察到类器官在贴壁培养条件下仍能保持与类器官状态相似的药物反应趋势，这为未来开发更适合大规模筛选的平台提供了可能。总之，本研究建立的滑膜肉瘤类器官模型是研究该疾病发病机制和探索新疗法的宝贵资源，其展现出的独特生物学行为强调了对复杂肿瘤微环境和细胞异质性进行更深入研究的必要性。该模型有望加速针对这种难治性肉瘤的新药开发进程。