基于实验设计的RP-HPLC生物分析方法开发与验证：用于大鼠血浆中替卡格雷定量分析及其药代动力学应用

《Journal of Pharmaceutical Innovation》：Design of Experiments-Based RP-HPLC Bioanalytical Method Development and Validation for Ticagrelor Quantification in Rat Plasma with Pharmacokinetic Application

建立并验证了经济高效的RP-HPLC法用于评估 ticagrelor 药代动力学，采用32全因子设计优化色谱条件，符合ICH M10验证标准，方法灵敏（检测限15.6 ng/mL）、准确（回收率88.9%±2.92%），适用于资源有限实验室的药代研究。

　　

摘要

目的

噻卡格雷（Ticagrelor，TGR）是一种P2Y12受体抑制剂，用于治疗急性冠状动脉综合征。本研究选择噻卡格雷作为研究对象，旨在建立并验证一种成本效益高的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法。通过采用32全因子设计，优化并验证了该方法的分析条件，以实现对大鼠血浆中噻卡格雷的定量分析，从而证明了该方法的成本效益、稳健性及其作为资源有限实验室中LC-MS/MS替代方法的适用性。

方法

色谱条件在C18柱上进行了优化，使用等度洗脱体系（由三氟乙酸缓冲液、乙腈和甲醇按46:48:6的比例配制，体积比），流速为1.0 mL/min。检测波长为278 nm，以维拉帕米（Verapamil）作为内标物。验证过程遵循ICH M10指南，并将该方法应用于大鼠的药代动力学研究。

结果

该方法能够获得分离效果良好、对称的色谱峰，噻卡格雷的洗脱时间为14.2 min。在100–4000 ng/mL的浓度范围内，该方法表现出线性响应（R2 = 0.9938 ± 0.0006）。灵敏度参数显示检测限为15.6 ng/mL，定量限为47.3 ng/mL。经过验证的最低检测限（LLOQ）为100 ng/mL。准确度在+0.47%至+2.81%之间，日内和日间精密度均低于6.16%（相对标准偏差RSD为3.00%至4.05%）。样品回收率较高（88.91 ± 2.92%），基质效应较小（< 2.17%）。该方法在冻融、室温、自动进样器以及长期储存条件下均表现出良好的稳定性。大鼠药代动力学研究表明，噻卡格雷的峰值浓度（Cmax）为428.56 ± 42.86 ng/mL，达峰时间（tmax）为1.75 ± 0.27 h，药物浓度-时间曲线下面积（AUC0–t）为2040.79 ± 204.08 ng·h/mL。

结论

通过全因子设计优化的RP-HPLC方法具有高灵敏度和精密度，为无法使用LC-MS/MS的情况下提供了经济可行的药代动力学研究工具。

图形摘要

• 采用32全因子设计优化了噻卡格雷的RP-HPLC分析色谱参数。
• 开发了一种简单、灵敏且经济高效的RP-HPLC方法，以维拉帕米作为内标物。
• 该方法表现出优异的线性关系（R2 = 0.9938）、准确度和精密度（< 6.16% RSD），以及较高的样品回收率（88.9%）。
• 该方法经过ICH M10生物分析指南的验证，并在多种条件下表现出良好的稳定性。
• 该方法成功应用于大鼠的药代动力学研究，证明了其在临床前研究中的适用性。