单细胞代谢谱分析揭示代谢亚群是生物生产异质性的驱动因素

《Nature Communications》：Single cell profiling framework reveals metabolic subpopulations as drivers of bioproduction heterogeneity

为解决克隆细胞群体中表型异质性导致生物生产产量下降的瓶颈问题，研究人员开发了一个基于单细胞生物传感器的标准化框架YTK-ScBiosense。该研究揭示了葡萄糖耗竭会诱导细胞分化为具有不同胞内pH(pHi)的亚群，并发现这些亚群对番茄红素和紫色杆菌素的生产效率具有相反的影响。通过将碳源从葡萄糖切换为半乳糖，研究人员成功将群体动态调控至高产表型，为设计更稳健、高产的菌株提供了新策略。

　　

在生物技术领域，利用微生物细胞工厂生产高价值化合物已成为一种可持续的替代方案。然而，一个长期存在的瓶颈是，即使在基因完全相同的克隆细胞群体中，也会出现显著的“表型异质性”。这种异质性意味着，在同一个发酵罐中，有些细胞是高效的“生产能手”，而另一些则是“低产者”，甚至完全不生产。这些低产细胞的存在严重拖累了整个发酵过程的最终产量和效率。

传统上，解决这一问题的方法依赖于构建复杂的反馈回路来主动筛选高产细胞，但这通常需要针对特定产物设计复杂的遗传电路，且会消耗细胞宝贵的资源。因此，科学家们迫切需要一种更普适、更根本的方法来理解这种异质性产生的根源，从而设计出更稳健、更高产的菌株。

为了做到这一点，研究人员需要能够“窥探”单个细胞内部的代谢状态。代谢物是细胞活动的动态指标，能迅速响应环境变化。然而，在单细胞水平上精确测量代谢物浓度在技术上极具挑战性。虽然单细胞代谢组学正在发展，但其成本高昂、通量低，难以广泛应用。相比之下，基因编码的荧光生物传感器提供了一种强大的替代工具，它能在活细胞中实时、无创地报告特定代谢物的浓度。

尽管已有许多生物传感器被报道，但它们在单细胞分析中的应用往往缺乏标准化，导致结果难以重复和比较。此外，生物传感器自身的表达也会引入新的异质性，干扰对真实代谢状态的解读。

为了克服这些挑战，来自帝国理工学院的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项研究，他们开发了一个名为YTK-ScBiosense的标准化、模块化框架。该框架整合了多种针对核心代谢物的生物传感器，旨在系统性地量化单细胞的代谢状态，并揭示代谢亚群在生物生产异质性中的驱动作用。

关键技术方法

研究人员首先从文献中筛选了9种已在酵母中验证功能的生物传感器，分别靶向胞内pH(pH_i)、果糖-1,6-二磷酸(FBP)、生长、NADH、NADPH、绝对ATP和ATP:ADP比率等核心代谢指标。这些传感器的核心感应单元被标准化为Level 0(L0)元件，并整合进广泛使用的酿酒酵母模块化克隆工具包(YTK)中。通过组合不同的启动子、报告基因和整合载体，研究人员构建了可定制的传感结构，并将其整合到基因组中以减少质粒表达带来的异质性。利用流式细胞术和微孔板读数仪，研究人员在群体和单细胞水平上验证了这些传感器的功能。通过分析单细胞信号分布，他们利用Hartigan's dip test统计量来量化亚群分化（宏观异质性），并利用流式细胞分选技术分离不同的代谢亚群，以进一步表征其表型差异。

结果

构建并验证了标准化的单细胞代谢传感工具包

研究团队成功构建了YTK-ScBiosense工具包，该工具包包含7个经过验证的传感单元，可与4种荧光蛋白报告基因、23种启动子和13种整合载体进行模块化组合。功能验证实验表明，这些传感器能够对相应的代谢扰动做出特异性响应。例如，pHluorin2传感器在弱酸处理后信号显著下降，而靶向NADPH的pYRE传感器在二酰胺处理后信号增强，均表现出剂量依赖性。这些结果证实了该工具包能够可靠地报告单细胞的代谢状态。

葡萄糖急性耗竭是诱导代谢亚群分化的关键触发因素

利用该工具包，研究人员系统性地分析了细胞在10种不同环境胁迫下的代谢响应。他们发现，在大多数条件下，细胞群体表现出相对均一的代谢响应。然而，在急性葡萄糖耗竭（如CSTRAVE和SMEtOH培养基）的条件下，细胞群体显著分化为两个稳定的、代谢特征截然不同的亚群。这种分化在多个代谢指标上均有体现，其中以胞内pH(pH_i)的差异最为显著。约20%的细胞（p1亚群）表现出pH_i的急剧下降，而其余大部分细胞（p2亚群）则能维持较高的pH_i水平。

p1和p2亚群具有不同的生存策略和表型特征

对CSTRAVE诱导的pH_i亚群进行深入表征发现，p2亚群在短期饥饿条件下表现出更强的生长能力和更高的存活率。然而，在长期饥饿条件下，p2亚群的生长优势逐渐消失。时间推移显微镜观察显示，p1和p2亚群在分化后保持稳定，没有观察到细胞在两个亚群之间的转换。通过流式分选和再培养实验，研究人员证实了这种异质性源于同基因异质性，而非自发突变。

pH_i亚群是生物生产异质性的直接驱动因素

为了探究代谢亚群对生物生产的影响，研究人员将pHluorin2传感器引入到生产紫色杆菌素和番茄红素的细胞工厂中，并在模拟分批发酵的条件下进行培养。结果显示，在葡萄糖耗竭后，两种生产菌株均出现了p1和p2亚群的分化。有趣的是，这两个亚群对两种产物的生产效率表现出截然相反的趋势。在紫色杆菌素生产菌株中，p1亚群（低pH_i）表现出更强的产物积累能力，其紫色杆菌素自荧光信号比p2亚群高7.36倍。相反，在番茄红素生产菌株中，p2亚群（高pH_i）的番茄红素产量是p1亚群的3.71倍。这表明，代谢亚群是导致生物生产异质性的直接原因，且其影响具有产物特异性。

通过调控培养策略可优化亚群动态以提高产量

鉴于p2亚群是番茄红素的高产表型，研究人员尝试通过改变培养条件来调控亚群比例。他们发现，将碳源从葡萄糖切换为半乳糖，可以显著降低p1亚群的比例（从69.8%降至31.6%），并同时将番茄红素的产量提高1.94倍。这种效应在微反应器培养和pH缓冲条件下依然稳健，表明通过优化培养策略来调控亚群动态是一种有效的产量优化手段。

结论与讨论

本研究开发了一个标准化的单细胞代谢谱分析框架，为系统研究同基因异质性提供了强大的工具。研究揭示了葡萄糖耗竭是诱导代谢亚群分化的关键环境触发因素，并证实了胞内pH(pH_i)亚群是驱动生物生产异质性的直接原因。更重要的是，研究证明了这种异质性对生产效率的影响是产物依赖性的，这解释了为什么在生物过程中优化策略往往需要“因物而异”。

该研究的核心意义在于，它提供了一种绕过单细胞产物定量的新策略。通过将胞内pH(pH_i)等代谢状态作为生产效率的代理指标，研究人员可以更直接地指导生物过程的设计和优化。最后，通过将碳源从葡萄糖切换为半乳糖，成功地将群体动态调控至高产表型，这为开发更稳健、更高产的微生物细胞工厂提供了新的工程策略。未来，通过多组学手段进一步阐明亚群分化的分子机制，将有助于发现新的工程靶点，从而在基因层面锁定高产表型，实现生物制造的精准调控。