探索单细胞生物合成噪声与动态以增强大肠杆菌中甜菜黄素生产

《Nature Communications》：Exploring single-cell biosynthetic noise and dynamics for enhanced betaxanthin production in Escherichia coli

本研究针对细胞间异质性限制微生物高效生物合成的难题，通过微流控时间推移显微镜技术实时追踪大肠杆菌异源甜菜黄素途径中酶（DOD）与代谢物动态波动，揭示酶噪声是代谢变异主要来源。研究人员开发随机模型筛选控制策略，实验验证酶表达生长耦合（Egos）策略可富集高产细胞，使产量提升4.4倍，为设计稳健微生物过程提供新范式。

　　

在微生物细胞工厂的优化过程中，一个长期存在的挑战是细胞间的异质性：即使在同一发酵罐中生长的基因相同细胞，其产物积累量也可能存在超过10倍的差异。这种非遗传性的细胞间变异深刻影响发酵过程的产量和产率，限制了微生物生物合成技术的经济性和可持续性。然而，单个细胞如何随时间波动，以及这些波动如何影响群体水平产出，至今仍不清楚。

近日发表在《Nature Communications》上的研究通过结合微流控时间推移显微镜和计算建模，深入探索了大肠杆菌中甜菜黄素生物合成的单细胞噪声和动态特性。研究人员发现，高产甜菜黄素细胞的特征极不稳定，超过50%的高产细胞在两次分裂后即变为中产或低产状态。更引人注目的是，他们开发出一种酶表达生长耦合策略，成功将甜菜黄素产量提高了4.4倍。

关键技术方法

研究团队采用微流控芯片培养技术，在稳态条件下对工程化大肠杆菌进行长时间单细胞追踪，同步监测细胞生长、分裂、酶表达（DOD-mCherry融合蛋白）和代谢物（甜菜黄素）生产。通过随机Gillespie算法建立生物合成模型，模拟分子反应和细胞群体动态。利用甲酰胺酶（FmdA）适应性进化构建生长选择系统，并通过核糖体结合位点（RBS）文库调控选择强度。

结果

单细胞中动态异质的酶和代谢物生产

研究人员构建了异源甜菜黄素生产途径，其中DOD酶与红色荧光蛋白mCherry融合，而甜菜黄素本身具有黄色荧光，使得能够同时监测单个细胞中的蛋白质和代谢物动态。结果显示，甜菜黄素在单细胞中的波动比DOD酶更为迅速，其自相关衰减半衰期仅为30±2.9分钟，而DOD为61±2.8分钟。这表明高产甜菜黄素细胞的特征保持时间较短，平均仅能维持2-3个细胞周期。

通过追踪细胞谱系发现，高DOD生产者的后代在7代后仍有32%保持高产特性，而高甜菜黄素生产者仅有22%维持高产状态。交叉相关性分析表明，DOD噪声贡献了约60%的甜菜黄素变异，而生长速率波动的影响较小。

生物合成的随机模拟

研究团队开发了一个包含四种分子物种（DOD蛋白p、底物L-DOPA d、代谢物甜菜黄素m和生长因子γ）的随机模型。该模型成功复现了实验观察到的单细胞行为，包括波动模式、自相关衰减和交叉相关性。通过扰动模拟发现，当消除DOD蛋白水平的波动时，生长波动成为甜菜黄素噪声的主要来源，反之亦然，证实了酶噪声在代谢变异中的核心作用。

基于酶的生长选择策略（Egos）

Egos策略通过将选择基因（Sel）与途径酶共表达，使高酶表达细胞获得生长优势。模型预测，提高选择阈值（h_p）可增强高产细胞的富集，但会导致初始生长延迟。在24小时发酵模拟中，Egos策略能显著提高最终代谢物滴度，且选择强度越大，增强效果越明显。

基于代谢物的生长选择策略（Megos）

Megos利用代谢物生物传感器将代谢物浓度与生长速率耦合。由于代谢物浓度的细胞间变异较小，需要更严格的选择阈值（如种群均值的10倍或20倍）才能有效富集高产细胞。与Egos类似，Megos也能提高最终滴度，但初始生产力下降更为明显。

生长因子反馈酶表达（Grofee）和代谢物反馈酶表达（Mefee）

这两种反馈调控策略对代谢物浓度和生产影响有限。Grofee仅在一定参数范围内提高蛋白滴度，而Mefee对代谢物生产几乎没有改善，表明简单的反馈调控不足以有效应对生物合成异质性。

模型预测选择策略的实验验证

研究人员实验构建了Egos系统，使用来自P. pasadenensis的甲酰胺酶（FmdA）突变体（M148I）作为选择标记。通过RBS文库调控选择强度，发现更严格的选择（较弱RBS）导致更明显的高产细胞富集和更长的滞后期。Egos4菌株（最严格选择）的甜菜黄素滴度比开放循环（无Egos）提高了4.4倍，与模型预测高度一致。

结论与展望

该研究首次全面揭示了甜菜黄素生物合成中单细胞噪声的来源和传播动力学，证明酶表达噪声是代谢变异的主要驱动力。通过计算模型指导的工程策略，研究人员证实生长耦合选择是应对生物合成异质性的有效手段。特别值得注意的是，Egos策略不依赖代謝物传感器，构建简单，适用于多种产品途径。

这项工作不仅为理解微生物生物合成的单细胞动态提供了新视角，也为优化工业生物过程提供了实用框架。未来，这种基于单细胞噪声分析的控制策略可广泛应用于药物、化学品、燃料和材料的高效生物制造，推动循环经济发展。研究展示的方法论和工程原理有望成为代谢工程领域的标准工具，特别是在需要应对细胞间异质性的复杂生物生产系统中。