自噬性细胞外囊泡（AEVs）：不同于外泌体的新型细胞间通讯载体及其在病毒感染中的关键作用

《Nature Communications》：Autophagic extracellular vesicles (AEVs) are distinct from exosomes and play crucial roles in viral infections

本研究针对细胞外囊泡异质性认知不足的问题，聚焦自噬与囊泡分泌的交叉领域，系统鉴定了新型自噬性细胞外囊泡（AEVs）。研究人员通过多组学分析发现AEVs具有独特生物标志物（Rab13/ESCRT-III），并证实其通过封装病毒颗粒/基因组显著增强感染效率。该研究为病毒传播机制提供了新范式，对EV相关疾病诊断具有重要价值。

　　

在细胞生物学领域，细胞外囊泡（EVs）长期以来被视为细胞间通讯的重要媒介。其中，直径小于200纳米的小细胞外囊泡（sEVs）因参与多种生理病理过程而备受关注。传统认为，外泌体（exosomes）是sEVs的主要代表，其生成过程涉及多泡体（MVBs）的形成和胞吐作用。然而，随着研究的深入，科学家们发现自噬过程与囊泡分泌之间存在密切联系，但这类自噬相关囊泡的特性及其功能仍不明确。

目前领域内面临的关键问题在于：自噬诱导条件下出现的特殊囊泡群体是否具有独特性？它们与传统外泌体有何本质区别？在病毒感染等病理条件下，这些囊泡又扮演着什么角色？这些问题不仅关系到对细胞外囊泡异质性的深入理解，也对揭示病毒传播新机制具有重要意义。

针对这些科学问题，苏州大学附属第四医院毛克丹、火芳芳等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。团队通过系统的实验证明，存在一种新型的自噬性细胞外囊泡（AEVs），其生物学特性和功能与传统外泌体存在显著差异。

研究采用了一系列关键技术方法：利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和电阻脉冲传感（RPS）技术精确测定囊泡粒径分布；通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建多种基因敲除细胞模型；采用蛋白质组学分析鉴定AEVs的特异性蛋白组成；借助透射电镜（TEM）和免疫电镜观察囊泡超微结构；建立密度梯度超速离心方法分离纯化AEVs；应用单囊泡表面蛋白分析技术解析囊泡异质性。

1. 饥饿诱导的自噬影响小细胞外囊泡的粒径分布

研究人员发现，在血清饥饿条件下，HEK-293T细胞分泌的sEVs出现双峰粒径分布，其中小于100纳米的囊泡比例显著增加。这一现象在多种细胞系（Neuro-2a、THP-1和SH-SY5Y）和小鼠血清中得到验证，表明自噬诱导可特异性促进小粒径囊泡的分泌。

2. 应激诱导的自噬反应导致小于100纳米sEVs分泌增加

除饥饿处理外，雷帕霉素处理、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、柯萨奇病毒B4（CVB4）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染均能诱导自噬并促进小于100纳米囊泡的分泌。临床样本分析显示，65岁以上老年人群血清中小于100纳米囊泡比例显著高于年轻群体，提示AEVs可能与年龄相关病理过程有关。

3. 自噬性细胞外囊泡（AEVs）代表sEVs的一个亚型且不同于外泌体

通过TSG101（外泌体生物发生关键蛋白）和ATG7（自噬必需蛋白）基因敲除实验，研究人员证实AEVs的分泌依赖于自噬过程而非经典的外泌体生成途径。Rab11介导的自噬体与MVBs融合形成amphisomes（混合细胞器）是AEVs生成的关键步骤。单囊泡蛋白分析进一步揭示了AEVs独特的表面蛋白谱。

4. AEVs具有独特的Rab GTPases和ESCRT组分组成

团队建立了高效的AEVs纯化方法（方法B），可获得纯度超过80%的AEVs。蛋白质组学分析显示，AEVs富含自噬相关蛋白、ESCRT-III复合物组分和Rab13。这些组分在Rab11敲除细胞的囊泡中显著减少，证实了它们在AEVs生物发生中的特异性。

5. 自噬货物、ESCRT-III组分和Rab13可作为区分AEVs与传统外泌体的标志物

密度梯度离心显示AEVs与外泌体密度相似，难以通过常规方法分离。蛋白酶保护实验和免疫电镜证实自噬货物（p62、NBR1）和Rab13位于AEVs膜上，而LC3B-II存在于囊泡内部。这些特异性标志物在THP-1和Neuro-2a细胞来源的AEVs中同样富集。

6. Rab13参与货物蛋白分选至AEVs但不影响其分泌

Rab13敲除不影响AEVs的分泌量，但显著降低自噬货物和ESCRT组分在AEVs中的富集。超微结构观察发现amphisomes内存在两种不同的腔室结构，分别对应自噬体来源的AEVs和MVBs来源的外泌体。

7. AEVs的生物发生依赖于ESCRT-III/VPS4和Rab27a

CHMP4A/CHMP4B和VPS4A/B敲低显著抑制AEVs分泌，并导致amphisomes内囊泡结构异常。Rab27a敲除同样抑制AEVs分泌，证实其在囊泡胞吐过程中的关键作用。

8. 封装肠道病毒感染元件的AEVs在非许可细胞中表现出感染性

研究发现CVB4病毒颗粒可被封装在AEVs中，有效感染缺乏病毒受体的NIH 3T3细胞。EV71病毒感染则导致病毒基因组被包装进AEVs，在非许可性L929细胞中表现出高感染效率。动物实验进一步验证了AEVs介导的病毒传播能力。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次系统鉴定了AEVs这一新型细胞外囊泡亚型。与传统外泌体相比，AEVs在生物发生途径、蛋白组成和功能特性方面均具有独特性。特别是在病毒感染过程中，AEVs可作为病毒传播的有效载体，通过规避宿主细胞受体限制显著增强感染效率。这一发现为理解病毒传播机制提供了新视角，对开发新型抗病毒策略具有重要意义。

此外，研究中建立的AEVs特异性分离鉴定方法为细胞外囊泡研究提供了技术支撑。AEVs特异性标志物（Rab13、ESCRT-III组分等）的发现，为基于细胞外囊泡的疾病诊断提供了新的生物标志物候选。特别是在病毒感染、年龄相关疾病等自噬异常激活的病理条件下，AEVs的检测可能具有重要的临床价值。

该研究不仅深化了对细胞外囊泡异质性的认识，也为理解病毒-宿主相互作用提供了新的理论框架。未来针对AEVs生物发生和功能的深入研究，有望为多种疾病的诊断和治疗开辟新的途径。