FDX1深度突变扫描揭示脂酰化与铜死亡的关键结构决定因素及DLD作为新型上游还原酶

《Nature Communications》：Deep Mutational Scanning of FDX1 Identifies Key Structural Determinants of Lipoylation and Cuproptosis

本研究针对铜死亡（cuproptosis）关键蛋白FDX1的结构与功能关系尚不明确的问题，通过深度突变扫描（DMS）技术，系统鉴定了FDX1第三个α螺旋上的两个保守酸性残基D136和D139是其介导蛋白脂酰化（lipoylation）和铜死亡所必需的关键结构决定因素。研究发现，将D136/D139突变为带正电荷的精氨酸（D136R/D139R）会特异性破坏FDX1在细胞内的功能，却不影响其体外酶活。进一步研究意外发现，二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）可作为FDX1的新型上游还原酶，揭示了脂酰化通路与铜死亡之间存在前所未有的直接调控联系。该成果发表于《Nature Communications》，为理解铜死亡分子机制和FDX1的多功能调控提供了新的结构基础和理论框架。

　　

铜是生命体必需的微量元素，但过量积累会产生毒性。近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——铜死亡（cuproptosis）被揭示，它由线粒体内的铜离子特异性蓄积所触发。铁氧还蛋白1（FDX1）被鉴定为铜死亡的关键调控因子，它一方面直接还原铜离子载体（如elesclomol, ES）结合的Cu(II)为Cu(I)，导致铜离子释放并引发毒性；另一方面，FDX1是线粒体蛋白脂酰化（lipoylation）过程所必需的，而脂酰化的蛋白（如DLAT、DLST）正是释放的铜离子的直接攻击靶点，最终导致蛋白聚集和细胞死亡。尽管FDX1在铜死亡中的核心地位已确立，但其如何协调执行这两项功能的结构基础，以及其上游调控机制，仍是未解之谜。

为系统解析FDX1的结构与功能关系，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们综合运用深度突变扫描（DMS）、生物化学、细胞生物学和生物信息学等多种技术手段，对FDX1进行了全方位的探究。研究使用的细胞模型包括人肺腺癌细胞ABC1和人胚胎肾细胞HEK293T。关键技术主要包括：利用CRISPR/Cas9技术构建FDX1基因敲除（KO）细胞系；通过深度突变扫描（DMS）技术构建并筛选覆盖FDX1全长的饱和突变体文库，以鉴定功能关键残基；利用蛋白质纯化技术获得野生型和突变型FDX1蛋白，并进行体外酶活分析（如LIAS介导的脂酰化 assay）；采用温度相关强度变化（TRIC）荧光法测定蛋白质-蛋白质相互作用亲和力；通过免疫共沉淀（Co-IP）验证细胞内蛋白相互作用；以及利用癌症依赖图谱（DepMap）数据库进行基因依赖性相关性分析等。

Deep mutational scanning defines FDX1 structure-function

研究人员首先在ABC1和HEK293T细胞中成功构建了FDX1敲除模型，该模型对ES诱导的铜死亡产生抵抗，而回补野生型FDX1则可恢复甚至增强其敏感性，这为后续的功能筛选奠定了基础。随后，他们构建了一个涵盖FDX1每个氨基酸所有可能置换（包括错义、无义和同义突变）的饱和突变体文库，并将其导入FDX1 KO细胞中。通过在ES存在与否的条件下培养细胞并监测各突变体对细胞存活的影响，研究人员绘制了FDX1的“功能图谱”。结果显示，破坏线粒体靶向信号、蛋白质结构稳定性或铁硫（Fe-S）簇结合的突变均会导致功能丧失。尤为引人注目的是，位于第三个α螺旋（α-helix 3）上的两个溶剂暴露的酸性残基——D136和D139，其对突变为带正电荷氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）特别敏感，提示它们可能通过静电相互作用在FDX1功能中扮演关键角色。

Charge reversal on α-helix 3 disrupts FDX1 function

为验证DMS结果，研究人员构建了D136和D139的点突变体（丙氨酸置换D136A/D139A以消除负电荷但保持结构；精氨酸置换D136R/D139R以反转电荷）。细胞实验表明，野生型FDX1以及中性突变体D136A/D139A均能有效恢复FDX1 KO细胞对ES/ES-Cu的敏感性以及DLAT/DLST的脂酰化水平。然而，电荷反转突变体D136R和D139R则完全丧失了恢复铜死亡敏感性和蛋白脂酰化的能力。在HEK293T细胞中，D136R和D139R也未能挽救FDX1 KO导致的细胞色素c氧化酶II（COX-II）表达下降以及低葡萄糖条件下的生长缺陷。这些结果强有力地证明，D136和D139位点的负电荷对于FDX1在细胞内的功能至关重要，电荷反转会特异性破坏其介导脂酰化和铜死亡的能力。

FDX1 mutants are enzymatically active in vitro

令人困惑的是，当研究人员在体外纯化这些FDX1突变体蛋白并检测其酶活时，发现所有突变体（包括D136R和D139R）在由FDXR提供电子、LIAS催化的脂酰化反应中均保持了近乎完全的活性。TRIC结合实验进一步表明，这些突变并不显著影响FDX1与FDXR或LIAS的体外直接结合。此外，突变体的氧化还原电位也与野生型相似。这些体外数据与细胞表型形成了鲜明对比，表明D136R/D139R突变体本身具有完整的催化能力，其在细胞内的功能缺失并非由于蛋白质结构不稳定或固有酶活受损，而是可能源于其与细胞内特定因子（如上游电子供体）相互作用的障碍。

DLD can replace FDXR in reducing FDX1

基于上述矛盾，研究人员推测FDX1在细胞内可能存在FDXR之外的上游还原酶。通过对癌症依赖图谱（DepMap）数据库的分析，他们发现FDX1的基因依赖性与其经典还原酶FDXR的相关性并不强，反而与脂酰化通路中的二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）高度相关。DLD是酮酸脱氢酶复合体的E3组分，已知具有脱氢酶和双酶（diaphorase，可催化电子从NADH转移到多种电子受体）活性。结构同源性分析也提示DLD与FDXR存在相似性。随后的实验证实了这一猜想：免疫共沉淀显示，在细胞内，FDX1与DLD的结合强于与FDXR的结合，且D136R/D139R突变会显著削弱FDX1与DLD的相互作用，但不影响与FDXR的结合。体外功能实验表明，DLD可以像FDXR一样，有效地作为电子供体支持FDX1依赖的LIAS脂酰化活性。在细胞中，敲低DLD会在一定程度上降低蛋白脂酰化水平。此外，在HEK293T细胞中过表达DLD（而非FDXR）可增强对ES诱导铜死亡的敏感性。这些结果综合表明，DLD是FDX1在细胞内的一个重要的上游功能性还原酶。然而，在体外TRIC实验中未能检测到FDX1与DLD的直接强结合，提示细胞内可能存在辅助因子或特定环境来稳定FDX1-DLD复合物。

本研究通过深度突变扫描精准定位了FDX1分子表面一个关键的功能界面——第三个α螺旋上的D136和D139残基。研究揭示，这两个残基所携带的负电荷是FDX1在细胞内执行其脂酰化和铜死亡促进功能所必需的，电荷反转突变会选择性破坏这些功能，同时保持蛋白质的固有酶活性。这一现象引导研究者发现了一个新的调控层面：DLD，作为脂酰化通路的核心组分，同时也可以作为FDX1的上游还原酶。这表明FDX1在功能上和物理上可能与脂酰化复合物紧密偶联。该研究不仅阐明了FDX1双重功能的结构基础，揭示了其功能不可分割的特性，还提出了一个新颖的模型：FDX1通过其酸性α螺旋3与上游还原酶（如DLD）相互作用，从而将其脂酰化功能与铜死亡诱导过程紧密联系在一起。这为理解铜死亡的分子调控网络提供了新的视角，并提示靶向FDX1与DLD等相互作用界面可能为干预铜死亡相关病理过程提供新的策略。