3D MINFLUX显微技术实现心肌兰尼碱受体亚基解析及其细胞原位三维取向测定

《Nature Communications》：MINFLUX microscopy resolves subunits of the cardiac ryanodine receptor and its 3D orientation in cells

本研究针对传统超分辨显微技术难以解析心肌兰尼碱受体(RyR2)原位三维构象的难题，利用3D MINFLUX纳米显微技术结合单域抗体标记，首次实现了RyR2四聚体亚基的单分子级分辨（精度达3纳米）及其在细胞内的三维取向解析。该技术不仅揭示了心肌细胞中RyR2簇的紧密空间排布特征，更通过定量标记效率分析（约50%）澄清了电子显微镜与超分辨显微数据间的长期争议，为心脏钙信号传导机制的深入研究提供了关键技术支撑。

　　

在心脏跳动的背后，隐藏着精密的钙信号传导系统。心肌兰尼碱受体(RyR2)作为钙诱导钙释放(Ca²⁺-induced Ca²⁺release, CICR)的核心通道，其纳米尺度的空间排列直接调控着心脏的收缩功能。然而，传统显微技术始终难以破解RyR2在细胞内的真实三维构象——就像试图通过模糊的卫星图来辨识建筑内部结构一般，科学家们长期被困在分辨率不足的困境中。

以往研究通过电子显微镜(EM)发现RyR2在心肌细胞中呈现紧密簇状分布，而超分辨光学显微技术却显示其排列相对稀疏，这种矛盾让学界对RyR2的真实组织方式充满疑问。更关键的是，RyR2四聚体中四个亚基的相对取向可能直接影响通道间的协同激活，但现有技术始终无法在细胞原位实现亚基级别的三维解析。这些悬而未决的问题，促使Christian Soeller团队在《Nature Communications》发表的最新研究中，引入了革命性的3D MINFLUX显微技术。

研究人员创新性地将3D MINFLUX与DNA-PAINT成像术结合，通过单域抗体(sdAB)标记策略，对HEK293细胞和小鼠心室肌细胞中的RyR2进行纳米级成像。该技术平台实现了各向同性分辨率达3纳米的三维定位精度，相当于在百米赛跑中实现毫米级测量。为验证标记可靠性，团队同步利用核孔复合体(NPC)作为分子标尺，定量证实了51.2%的标记效率，这意味着单个RyR2四聚体的检测概率高达94%。

在技术方法层面，研究主要依托：1）3D MINFLUX显微系统结合DNA-PAINT成像术实现纳米级三维定位；2）单域抗体标记技术减小空间位阻；3）核孔复合体校准体系定量标记效率；4）DBSCAN算法进行功能性簇分析（距离阈值100纳米）；5）电子断层扫描数据对比验证。实验样本包括稳定表达RyR2_D4365-GFP的HEK293细胞系和PA-RFP RyR2基因敲入小鼠分离的心室肌细胞。

3D MINFLUX成像解析HEK293细胞中RyR2分布

通过三维重构发现，RyR2在内质网中呈现复杂的立体架构。与宽场DNA-PAINT相比，MINFLUX数据在轴向分辨率上显著提升，清晰揭示了RyR2簇在z轴方向的延伸特征（图1）。这种三维信息对于准确判定功能性RyR2簇至关重要。

原位标记效率与检测概率定量

创新性的共培养实验设计（图2）使研究人员能够同步采集U2OS-Nup96-mEGFP核孔数据与RyR2成像数据。通过三维模板拟合分析，测得GFP标记效率为51.2%±2.3%，且每位点平均访问次数为1.18±0.09，证实了数据采集的充分性且未出现过度计数。

RyR2四聚体亚基与三维取向解析

研究首次在光学显微层面分辨出RyR2四聚体的亚基结构（图3）。通过分析相邻亚基的空间排列（如四聚体中方形成员间距约16纳米），成功推断了RyR2在细胞内的三维取向。这种取向信息对于理解通道间相互作用具有重要意义。

HEK293细胞中RyR2簇特征

基于钙扩散模型设定100纳米距离阈值进行DBSCAN聚类分析（图4），发现HEK293细胞中存在包含数千个亚基的巨型RyR2簇。校正标记效率后，平均每个簇包含14.7±2.1个RyR2，且三大主要簇集中了34.8%的受体，这种宏观簇结构可能支持钙信号的长距离传播。

心室肌细胞中RyR2的MINFLUX成像

在PA-RFP RyR2基因敲入小鼠心肌细胞中（图5），MINFLUX清晰分辨出表面膜下和横小管内部的RyR2簇。尽管平均簇大小仅为2.3±0.1个RyR2，但72.4%的受体集中于含50个以上亚基的大型簇中，揭示了"少量大簇主导，大量小簇并存"的分布模式。

MINFLUX数据与电子断层扫描数据的关联

通过模拟50%标记效率下的电子断层扫描数据（图6），发现生成的RyR2簇形态与MINFLUX实验结果高度一致，从而解释了先前超分辨显微与电子显微数据间的差异主要源于标记效率限制。

这项研究通过MINFLUX纳米显微技术实现了心肌钙释放通道的原位三维解析，将光学显微分辨率推向了真正的分子尺度。不仅澄清了领域内长期存在的技术争议，更建立了定量分析膜蛋白纳米结构的标准流程。特别值得关注的是，该技术能够捕获RyR2四聚体的三维取向信息，为研究病理条件下（如心力衰竭）通道排列变化提供了全新视角。随着多色MINFLUX技术的发展，未来有望实现钙处理蛋白网络的全面解析，最终构建出心脏钙信号传导的分子级图谱。这种技术路径也适用于其他多亚基蛋白复合物的研究，为细胞超微结构生物学开辟了新纪元。