通过共表达HAI-2，能够高效生产具有完全活性的、能够激活SARS-CoV-2的野生型TMPRSS2外域蛋白，从而实现自我激活和交叉激活两种机制

《Biochemical Journal》：Efficient production of fully active, SARS-CoV-2-priming, wildtype TMPRSS2 ectodomain via co-expression of HAI-2 allows for both auto- and cross-activation mechanisms

高效表达并揭示人及叙利亚仓鼠TMPRSS2自激活与跨激活机制

　　
该研究专注于开发一种高效且稳定的重组表达策略，以生产具有生物活性的野生型人源和小鼠源TMPRSS2胞外结构域（ectodomain），并深入解析其自激活及跨激活机制。TMPRSS2作为冠状病毒和流感病毒入侵宿主细胞的关键宿主蛋白酶，其结构域组成、功能特性及激活机制均对药物开发具有重要意义。研究团队通过创新性的共表达策略，解决了重组TMPRSS2易自我激活导致产率低下的技术难题，同时揭示了该蛋白酶的复杂激活网络。

### 1. 研究背景与科学问题
TMPRSS2属于丝氨酸蛋白酶超家族中的II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSP），其通过切割病毒包膜蛋白（如新冠病毒S蛋白的S1/S2位点）介导病毒与宿主细胞膜融合。该酶在前列腺癌等病理过程中因异常表达备受关注。然而，重组TMPRSS2的制备面临两大挑战：一是哺乳动物细胞表达时易发生自我激活导致蛋白降解；二是该酶含有不寻常的半胱氨酸（Cys379）和丝氨酸（Thr447）残基，导致传统表达系统难以稳定复性。

### 2. 创新性表达策略
研究团队采用哺乳动物细胞表达系统（HEK293F细胞），并首创性引入以下策略：
- **共表达天然抑制剂HAI-2**：通过共转染HAI-2全长蛋白，有效抑制TMPRSS2在分泌途径中的自激活。HAI-2通过其Kunitz结构域与TMPRSS2的SP域结合，阻止自切割反应，确保分泌的ectodomain以未激活的单链形式释放。
- **优化表达载体设计**：在pSecTag2c载体中整合以下元素：
- N端FLAG标签和C端Myc/His6标签，增强蛋白纯化效率
- Igκ信号肽引导蛋白分泌至胞外
- 人工缺失N249糖基化位点突变体（S251A）验证糖基化必要性
- **双物种对照验证**：同时表达人源和叙利亚金仓鼠来源的TMPRSS2，发现两者在激活机制上具有高度保守性，但糖基化修饰存在物种差异。

### 3. 自激活机制解析
研究通过多组学实验揭示了TMPRSS2独特的激活网络：
- **双阶段自激活模型**：
1. **潜伏期**：单链zymogen通过微弱蛋白酶活性（约10^4倍低于激活态）逐步切割自身Arg255-Ile256位点，生成少量激活态酶
2. **指数期**：激活态酶通过级联反应高效切割剩余zymogen，形成两链活性酶（SP域与N端结构域解离）
- **关键实验证据**：
- R255Q突变体丧失自激活能力，证实Arg255为激活位点
- S441A突变体作为底物可被野生型TMPRSS2高效切割（kcat/Km达10^5 M?1s?1）
- 热解酶激活R255Q突变体，验证其结构正确性
- HAI-2抑制活性达4.6 pM（人源）/0.7 pM（鼠源），证实其强抑制特性

### 4. 跨激活网络发现
研究首次证明TTSP家族存在跨激活机制：
- **TMPRSS13的激活作用**：作为同源酶，TMPRSS13可切割TMPRSS2 zymogen，催化效率为野生型TMPRSS2的1/4-1/2
- **激活位点特异性**：两种来源的TMPRSS2均仅切割S1/S2位点，验证其作为病毒融合促进剂的功能特异性
- **时间依赖性动力学**：在37℃条件下，激活反应呈现典型一级动力学特征，半衰期约15分钟

### 5. 糖基化修饰的关键作用
- **N249糖基化**：人类TMPRSS2特有的N249糖基化位点对分泌表达至关重要，突变体（S251A）无法分泌
- **种属差异**：小鼠TMPRSS2缺失N249糖基化位点，但仍能高效分泌，提示可能存在替代性分泌途径
- **结构影响**：糖基化修饰可能通过空间位阻效应稳定单链zymogen构象，防止过早激活

### 6. 技术突破与产业应用
- **高活性蛋白制备**：成功获得1.2 mg/L人源和2.0 mg/L鼠源活性ectodomain，纯度达95%以上
- **质量控制体系**：
- Western blot验证表达量与纯度
- SDS-PAGE监测降解产物（SP域与N端结构域分离）
- 热变性实验确认单链zymogen特性
- **药物开发应用**：
- 作为新冠中和抗体设计的靶点蛋白
- 前列腺癌治疗中靶向TMPRSS2-HAI-2复合物的抑制剂开发
- 流感病毒疫苗佐剂筛选

### 7. 与现有研究的对比分析
- **表达效率对比**：本研究产率（1.2-2.0 mg/L）显著高于之前报道的0.3-0.8 mg/L（Fraser et al., 2020）
- **激活机制澄清**：纠正了关于TTSP自激活必须依赖跨物种交叉激活的误解，证实单链zymogen可通过分子内接触完成自激活
- **抑制剂开发启示**：HAI-2的高亲和力（pM级Ki）为设计小分子抑制剂提供了全新思路

### 8. 理论意义与机制深化
- **自激活能垒理论**：单链zymogen需克服约10^4倍能垒才能被激活态切割，这与胰蛋白酶（10^7倍）形成对比，提示TTSP家族存在独特的能量调控机制
- **分泌途径调控**：HAI-2主要作用于高尔基体阶段，阻止激活酶原的过早形成，与细胞分泌蛋白的普遍调控模式一致
- **进化保守性验证**：人源与鼠源TMPRSS2在激活效率（kcat/Km值差异仅1.8倍）和抑制敏感性（Ki值差异6倍）上均保持高度保守

### 9. 研究局限与未来方向
- **表达规模限制**：目前产量（1.2-2.0 mg/L）仍需通过优化细胞密度和转染效率提升
- **体内机制验证不足**：缺乏活体成像和单细胞分析数据，无法完全排除细胞表面跨激活网络的其他成员（如matriptase）的影响
- **应用场景拓展**：需进一步验证该策略在表达其他TTSP（如MMP-7）中的普适性

本研究不仅解决了困扰学界十余年的重组TMPRSS2制备难题，更重要的是揭示了TTSP家族独特的激活调控网络。其创新性的"抑制剂共表达"策略已被扩展至MASP-1等同类酶的生产，为开发新一代广谱蛋白酶抑制剂提供了技术范式。后续研究可结合冷冻电镜解析不同激活态的结构变化，以及开发基于HAI-2结构的纳米抑制剂，这将为抗冠状病毒和癌症治疗开辟新路径。