FKBP12.6通过调控精子特异性钙调磷酸酶介导FK506诱导的男性不育新机制

《Molecular Biomedicine》：FK506 binding protein 12.6-mediated inhibition of sperm-specific calcineurin is essential for FK506-induced male infertility by disturbing the homeostasis of calcium and mitochondria

本研究聚焦于免疫抑制剂FK506导致男性不育的机制难题。研究人员围绕FK506结合蛋白12.6（FKBP12.6）这一关键分子，深入探讨了其对精子特异性钙调磷酸酶（PPP3CC/PPP3R2）的抑制作用。结果揭示，FKBP12.6缺失可有效逆转FK506引起的精子钙离子（Ca2+）稳态失衡、线粒体功能紊乱及顶体反应异常，从而恢复精子活力。该研究为临床干预FK506相关男性不育提供了潜在新靶点。

　　

在全球范围内，不孕不育影响着约8%-12%的育龄夫妇，其中男性因素约占一半。精子活力受损是导致男性不育的主要原因之一。令人关注的是，临床上广泛使用的免疫抑制剂药物，如FK506（他克莫司），在肾移植男性受者中观察到其总体受精能力下降，并可导致雄性小鼠不育。这提示此类药物可能对男性生殖功能存在不容忽视的副作用。然而，其背后的具体分子机制尚未完全阐明，限制了临床上的有效干预。

钙离子（Ca²⁺）是调节精子功能的关键信号分子。钙调磷酸酶（Calcineurin）作为一种钙依赖性磷酸酶，在精子中特异性表达，由催化亚基PPP3CC和调节亚基PPP3R2组成，对精子鞭毛运动和顶体胞吐至关重要。研究表明，FK506可通过与其细胞内受体FK506结合蛋白（FKBPs）结合来抑制钙调磷酸酶的活性。在众多FKBPs中，FK506结合蛋白12（FKBP12）和12.6（FKBP12.6）被认为在临床相关浓度下能够介导FK506对钙调磷酸酶的抑制。但究竟是哪一个成员在FK506诱导的男性不育中扮演关键角色，以及其具体作用机制，特别是对精子不同发育阶段的影响，仍是未解之谜。

此外，细胞内钙稳态的维持依赖于钙库（如肌质网/内质网）的钙释放，其中兰尼碱受体（RyRs）是重要的钙释放通道。研究证实RyR2在附睾精子中表达，并且RyR2基因敲低会阻碍孕酮诱导的精子运动。值得注意的是，FKBP12.6被发现选择性结合RyR2，并在调节钙释放中起关键作用。同时，钙调磷酸酶本身也能通过FKBP12.6调节RyR2的钙释放。那么，FK506是否通过解离FKBP12.6与RyR2的结合和/或通过与FKBP12.6形成复合物抑制钙调磷酸酶活性，进而影响精子内的钙稳态，也值得深入探究。

线粒体作为细胞的能量工厂，在男性生育能力中扮演基础性角色。在哺乳动物精子中，线粒体集中于鞭毛的中段，而该区域恰好是FK506影响精子功能的部位。动力相关蛋白1（Drp1）是调控线粒体分裂的关键蛋白，其Ser637位点的磷酸化状态受到钙调磷酸酶的调节。FK506是否通过FKBP12.6影响钙调磷酸酶活性，进而干扰Drp1的磷酸化，破坏线粒体动态平衡，最终导致精子功能异常，也是一个有趣的科学问题。

为了解决这些疑问，研究人员在《Molecular Biomedicine》上发表了他们的最新研究成果。他们利用FKBP12.6基因敲除（FKBP12.6^-/-）小鼠模型，深入探究了FKBP12.6在FK506诱导的男性不育中的作用及其分子机制。

为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。他们构建并使用了FKBP12.6基因敲除（FKBP12.6^-/-）小鼠模型，并通过皮下注射FK506或环孢素A（CsA）进行体内干预。精子功能通过计算机辅助精子分析系统评估活力，并通过自然性受精实验评估受精能力。蛋白质相互作用通过GST Pull-down和免疫共沉淀等技术进行验证。细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）使用Fluo-4 AM荧光探针检测，线粒体膜电位和活性氧水平分别使用JC-1和MitoTracker探针进行评估。蛋白质表达和磷酸化水平通过蛋白质印迹法分析，关键蛋白的定位和表达通过免疫荧光染色观察。此外，研究还使用了来自南昌大学第一附属医院生育与生殖医学中心的符合世界卫生组织标准的人类正常精液样本进行体外实验验证。

FKBP12.6缺陷缓解了FK506诱导的雄性不育，且不影响睾丸和附睾的形态

研究人员首先确认FKBP12.6在成年雄性小鼠精子中高表达于睾丸、附睾头（caput）和附睾体（corpus），而在附睾尾（cauda）中表达较低，并在FKBP12.6^-/-小鼠中验证了其表达缺失。体内实验表明，给予野生型（WT）小鼠FK506 14天后，精子中段僵直率显著增加，精子总活力和前进活力明显下降，自然性受精率降低。重要的是，FKBP12.6的缺失显著逆转了FK506引起的这些不良变化。同时，组织学检查和睾丸重量分析显示，FK506处理并未改变WT和FKBP12.6^-/-小鼠睾丸和附睾的形态结构。这些结果表明，FKBP12.6缺陷通过增强精子活力来对抗FK506诱导的雄性不育，且不损害生殖器官的形态。

FKBP12.6缺陷通过减少ROS生成和改善MMP来减轻FK506诱导的未成熟精子线粒体功能紊乱

线粒体功能与精子活力密切相关。研究发现，FK506处理显著增加了小鼠附睾体（代表未成熟精子）和附睾尾（代表成熟精子）精子以及人类成熟精子中的活性氧（ROS）水平，并降低了线粒体膜电位（MMP）。关键的是，FKBP12.6缺陷显著降低了FK506在附睾体来源的未成熟精子中诱导的过量ROS生成，并改善了其MMP，但对附睾尾来源的成熟精子作用有限。这表明FKBP12.6缺陷主要通过维持未成熟精子的线粒体稳态来发挥保护作用。

FK506-FKBP12.6复合物优先结合睾丸中的精子特异性钙调磷酸酶（PPP3CC/PPP3R2）

为了阐明机制，研究人员检测了FKBP12和FKBP12.6在不同组织中的表达。发现虽然FKBP12的表达量普遍高于FKBP12.6，但FKBP12.6在心脏、睾丸和脑组织的微粒体（富含钙库）中富集。进一步的体外Pull-down实验表明，在FK506存在下，GST标签的FKBP12.6能特异性结合小鼠睾丸裂解液中的PPP3CC和PPP3R2，并且纯化的His标签PPP3CC和PPP3R2蛋白也优先与FKBP12.6结合。这些结果提示，FK506-FKBP12.6复合物可能对精子特异性钙调磷酸酶具有更强的亲和力和抑制能力。

FKBP12.6缺陷逆转了FK506诱导的未成熟精子中DSCR1.1表达上调和PPP3CC/PPP3R2表达下调

唐氏综合征临界区1.1（DSCR1.1）是钙调磷酸酶的抑制剂。研究发现，FK506处理14天可显著提高WT小鼠睾丸和附睾中DSCR1.1的蛋白表达，并降低PPP3CC和PPP3R2在附睾远头（distal caput）、附睾体和附睾尾中的表达。值得注意的是，环孢素A（CsA）处理并未引起类似变化。在短期（1天）FK506处理中，这种DSCR1.1上调和PPP3CC/PPP3R2下调的现象在附睾头和附睾体的未成熟精子中更为明显，而在附睾尾的成熟精子中变化不显著。FKBP12.6缺陷有效阻止了FK506在未成熟精子中引起的这些蛋白表达异常。这表明FKBP12.6介导了FK506对未成熟精子钙调磷酸酶功能的早期抑制。

FKBP12.6缺陷通过恢复钙调磷酸酶介导的RyR2 S2808和S2814位点去磷酸化来逆转FK506诱导的钙释放异常

通过Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测，研究发现FK506显著增加了未成熟精子（来自睾丸、附睾头、附睾远头和附睾体）的静息细胞内钙浓度（[Ca²⁺]_i），并降低了咖啡因诱导的细胞内钙库钙释放，但对成熟精子（来自附睾尾）和人类成熟精子的钙信号影响较小。FKBP12.6缺陷显著逆转了FK506在未成熟精子中引起的钙释放异常。机制上，免疫荧光显示FKBP12.6与RyR2在精子中共定位。蛋白质印迹分析发现，FK506处理提高了WT小鼠睾丸中RyR2蛋白Ser2808和Ser2814位点的磷酸化水平，而FKBP12.6缺陷则抑制了这种超磷酸化。这表明FKBP12.6缺陷通过调节钙调磷酸酶对RyR2的去磷酸化作用，维持了未成熟精子的钙稳态。

FKBP12.6缺陷通过保留钙调磷酸酶活性降低FK506诱导的Drp1 S637位点超磷酸化

线粒体分裂蛋白Drp1的Ser637位点磷酸化受钙调磷酸酶调节。结果显示，FK506处理14天增加了精子各个发育阶段Drp1 Ser637的磷酸化水平。体外实验中，FK506处理也显著提高了WT小鼠附睾远头和附睾体来源的未成熟精子中p-Drp1 S637的水平，而FKBP12.6缺陷则显著逆转了这一现象。然而，线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的表达未受FK506影响。这表明FKBP12.6缺陷通过维持钙调磷酸酶活性，减轻了FK506对未成熟精子线粒体分裂动力学的不利影响。

FKBP12.6缺陷通过抑制Snap25下调来恢复FK506诱导的精子顶体胞吐功能减退

顶体反应是精子受精的关键步骤。研究发现，FK506处理14天显著降低了WT小鼠精子经A23187诱导的顶体反应率，并下调了未成熟精子中突触体相关蛋白25kDa（Snap25）的表达，而CsA处理无此效应。FKBP12.6缺陷则保护了精子免受FK506引起的顶体反应功能减退和Snap25下调。值得注意的是，体外FK506处理并未影响人类成熟精子的中段僵直率、活力、前进活力及顶体反应率。这进一步支持了FK506主要影响精子在附睾中的成熟过程（如顶体胞吐功能成熟），而非直接损害已成熟的精子功能。FKBP12.6缺陷通过维持Snap25的表达，保护了精子顶体胞吐功能的正常成熟。

综上所述，本研究系统阐明了FKBP12.6在FK506诱导的男性不育中的核心作用。研究发现，FK506通过与FKBP12.6形成复合物，优先结合并抑制精子特异性钙调磷酸酶（PPP3CC/PPP3R2）的活性。这不仅直接抑制了钙调磷酸酶的功能，还意外地上调了其内源性抑制剂DSCR1.1的表达，并可能导致PPP3CC/PPP3R2的降解，从而放大了抑制作用。这种抑制进而扰乱了未成熟精子内的钙稳态（通过影响RyR2磷酸化）和线粒体功能（通过影响Drp1磷酸化），并损害了顶体反应关键蛋白Snap25的表达，最终导致精子活力下降和受精能力减弱。尤为重要的是，基因敲除FKBP12.6能够显著缓解FK506的这些负面效应，尤其是在精子的早期成熟阶段。

该研究的创新性在于明确了FKBP12.6（而非FKBP12）是介导FK506生殖毒性的关键分子；揭示了FK506除了直接抑制酶活性外，还能通过上调DSCR1.1这一新颖机制放大对钙调磷酸酶的抑制；并系统阐明了从钙调磷酸酶抑制到钙信号紊乱、线粒体功能障碍和顶体反应受损的完整信号通路。这些发现为理解FK506所致男性不育的分子机制提供了深刻见解。鉴于FKBP12.6缺陷在生理条件下不影响小鼠的生育结局、精子活力及顶体反应功能，靶向FKBP12.6可能为临床预防或治疗FK506相关男性不育提供一种高特异性且安全的潜在策略，具有重要的临床转化价值。