PRMT7介导的精氨酸单甲基化稳定SOX9蛋白促进非小细胞肺癌进展的机制研究

《Molecular Biomedicine》：Protein arginine methyltransferase 7-mediated arginine mono-methylation stabilizes SRY-box transcription factor 9 to promote non-small cell lung cancer progression

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)中SOX9蛋白稳定性调控机制不明的科学问题，系统揭示了PRMT7通过催化SOX9第160位精氨酸(R160)的单甲基化(MMA)，拮抗KEAP1/FBXW7介导的泛素化降解，从而稳定SOX9蛋白并促进NSCLC恶性进展的全新机制。该发现不仅阐明了PRMT7-SOX9轴在肺癌中的关键作用，更为NSCLC靶向治疗提供了潜在新策略。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占病例的85%。尽管诊断和治疗取得了进展，但NSCLC的发病率和死亡率仍然很高且持续上升，因此深入了解NSCLC进展的分子机制具有重要的临床意义。

SRY-box转录因子9(SOX9)在胚胎发育和肿瘤发生中起着关键作用。在NSCLC中，高SOX9表达与晚期组织学分期和不良预后相关。SOX9的表达和活性受到转录和翻译后修饰(PTM)的严格调控。此前研究表明，SOX9蛋白可通过KEAP1或FBXW7经泛素-蛋白酶体系统降解。新兴证据表明，精氨酸和赖氨酸甲基化可通过调节其泛素化来调控SOX9稳定性。然而，精氨酸甲基化是否直接调控NSCLC中SOX9蛋白稳定性仍不清楚。

蛋白质精氨酸甲基化是由蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)催化的关键翻译后修饰，调节包括亚细胞定位和蛋白稳定性在内的多种细胞过程。PRMT7是唯一的III型酶，专门催化精氨酸单甲基化。PRMT7可能发挥抑癌或促癌作用，主要通过甲基化组蛋白和非组蛋白底物实现。尽管取得了这些进展，PRMT7在NSCLC中的具体底物和机制作用仍不清楚。

本研究旨在筛选能够调控SOX9蛋白稳定性的PRMTs，并深入探讨PRMT7调控SOX9的分子机制及其在NSCLC进展中的生物学功能。论文最终发表在《Molecular Biomedicine》期刊上。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9技术构建PRMT7基因敲除细胞系；通过免疫共沉淀(Co-IP)和免疫印迹(IB)分析蛋白相互作用和修饰；采用体外甲基化实验验证PRMT7对SOX9的直接催化作用；通过环己酰亚胺(CHX)追踪实验评估蛋白半衰期；进行体内外泛素化分析探究蛋白降解机制；利用细胞增殖、集落形成和划痕实验评估细胞恶性表型；建立裸鼠异种移植瘤模型验证体内肿瘤生长；通过免疫组织化学(IHC)分析临床组织样本中PRMT7和SOX9的表达及相关性。临床样本来源于上海欧德生物技术公司提供的人类NSCLC组织微阵列。

PRMT7以甲基转移酶活性依赖性方式正向调控SOX9蛋白丰度

为鉴定调控SOX9蛋白丰度的PRMTs，研究人员在HEK293T细胞中过表达各个PRMT并监测SOX9水平。结果显示，只有PRMT7能特异性结合并显著增加SOX9蛋白丰度。内源性和半内源性Co-IP以及免疫荧光染色实验证实了PRMT7与SOX9在细胞核内的相互作用。敲除PRMT7导致SOX9蛋白丰度显著降低，而过表达PRMT7则以外源性和内源性剂量依赖性方式显著增加SOX9蛋白丰度，但不影响mRNA水平。进一步实验表明，PRMT7的甲基转移酶活性对其维持SOX9蛋白丰度至关重要：过表达野生型(WT)PRMT7而非催化失活突变体(A32T)可增加SOX9蛋白丰度；使用特异性抑制剂SGC3027药理抑制PRMT7也会以剂量和时间依赖性方式降低SOX9蛋白丰度。

PRMT7通过抑制其泛素化和降解来增强SOX9蛋白稳定性

与SOX9经泛素-蛋白酶体途径降解的既定认识一致，蛋白酶体抑制剂MG132处理增加了SOX9蛋白水平，而PRMT7水平保持不变。研究人员假设PRMT7通过此途径影响SOX9蛋白稳定性。结果显示，MG132有效阻断了由PRMT7敲除或SGC3027处理引起的SOX9蛋白水平下降，表明PRMT7通过抑制其泛素化来增加SOX9蛋白水平。此外，过表达WT PRMT7而非A32T突变体延长了SOX9蛋白半衰期。敲低PRMT7增加了内源性SOX9的多聚泛素化，并伴随SOX9蛋白半衰期缩短。重要的是，在体内实验中，表达WT PRMT7而非A32T突变体显著降低了SOX9多聚泛素化。与PRMT7缺陷的效果类似，SGC3027处理强烈缩短了SOX9蛋白半衰期并以剂量依赖性方式增加了SOX9多聚泛素化。

PRMT7保护SOX9免受KEAP1或FBXW7介导的降解

为阐明PRMT7稳定SOX9蛋白的分子机制，研究人员绘制了PRMT7和SOX9之间的相互作用区域。PRMT7与SOX9的DIM、HMG和TA结构域相互作用，而SOX9优先与PRMT7的N端结构域相互作用。值得注意的是，PRMT7以剂量依赖性方式显著提高了SOX9 HMG结构域的蛋白水平。

由于KEAP1或FBXW7可泛素化并降解SOX9蛋白，研究人员探究了PRMT7是否能拮抗KEAP1或FBXW7介导的SOX9泛素化以维持其蛋白稳定性。确实，他们观察到过表达WT PRMT7而非A32T突变体可恢复由KEAP1或FBXW7介导的SOX9蛋白水平降低。然而，过表达PRMT7并未显著改变KEAP1或FBXW7蛋白水平，表明PRMT7并非通过直接降低KEAP1或FBXW7蛋白水平来维持SOX9蛋白稳定性。值得注意的是，异位表达PRMT7抑制了KEAP1或FBXW7与SOX9的相互作用。此外，过表达KEAP1或FBXW7增加了SOX9多聚泛素化，但此效应可被共表达WT PRMT7而非PRMT7 A32T突变体部分逆转。相应地，在敲低KEAP1和FBXW7后，异位表达PRMT7未能进一步抑制SOX9泛素化。

PRMT7催化SOX9在R160位点的精氨酸单甲基化

由于PRMT7可甲基化β-连环蛋白并抑制其蛋白泛素化和降解以维持其稳定性，研究人员探究了PRMT7是否影响SOX9的甲基化。确实，他们观察到异位表达PRMT7增加了SOX9单甲基化水平，而PRMT7敲除或SGC3027处理显著降低了其单甲基化水平，表明PRMT7催化了SOX9的精氨酸单甲基化。

近期研究表明PRMT7主要通过GAR(甘氨酸和精氨酸)基序和RXR(精氨酸X精氨酸)基序识别底物。具有这些基序的SOX9蛋白的R残基主要位于HMG和K2结构域。鉴于PRMT7特异性与SOX9的HMG结构域相互作用，研究人员检查了HMG结构域内跨物种保守的R残基(R160/162/177/178/179)。为鉴定PRMT7甲基化的SOX9特异性R残基，他们将5个R残基突变为赖氨酸(K)。体内甲基化实验表明，在其他测试的突变中，只有SOX9 R160K突变体逆转了由PRMT7异位表达介导的SOX9甲基化水平。体外甲基化实验证实PRMT7直接催化WT SOX9的甲基化，而非R160K突变体。相应地，PRMT7敲除抑制了WT SOX9的甲基化，但对细胞中的R160K突变体影响很小。与SOX9 WT相比，SOX9 R160K突变体的多聚泛素化增加，并伴随SOX9蛋白半衰期缩短。与对WT SOX9的作用相反，在体内和体外去泛素化实验中，PRMT7未能降低SOX9 R160K突变体的多聚泛素化。SOX9 R160K突变体在H1299细胞中也显示出比SOX9 WT更显著的集落形成抑制。

PRMT7依赖SOX9促进NSCLC的恶性表型

既往研究表明PRMT7过表达在体外促进NSCLC细胞系侵袭。本研究结果也揭示了其在增强体外增殖、迁移和集落形成中的作用。为进一步研究PRMT7在NSCLC进展中的作用，研究人员建立了肿瘤异种移植模型，发现PRMT7过表达在体内促进肿瘤生长。此外，PRMT7的基因敲除及其药理抑制均显著抑制了NSCLC体外增殖和体内肿瘤发生。对所得肿瘤的IHC分析显示SOX9蛋白水平随之降低，支持了PRMT7通过维持SOX9蛋白表达作为致癌驱动因子促进NSCLC进展的模型。

为确定PRMT7是否通过SOX9调控NSCLC的恶性表型，研究人员通过在PRMT7缺陷细胞中过表达SOX9-WT和SOX9 R160K突变体进行挽救实验。体外实验表明，在PRMT7敲除细胞中重新表达外源性SOX9-WT而非SOX9 R160K突变体，增加了细胞增殖、集落形成和迁移能力。一致地，在异种移植小鼠模型中，重新表达外源性SOX9-WT而非SOX9 R160K突变体显著恢复了由PRMT7敲除诱导的肿瘤发生减少。

PRMT7和SOX9的高水平与NSCLC不良预后相关

研究人员进一步研究了PRMT7-SOX9轴在NSCLC中的临床相关性。IHC染色和生物信息学分析显示，PRMT7和SOX9在NSCLC组织中的表达显著高于非肿瘤组织。Kaplan-Meier生存分析显示，SOX9或PRMT7高水平患者的总生存期(OS)显著短于低水平患者。此外，PRMT7和SOX9均高表达的患者预后比两者均低表达的患者更差。类似地，GENT2数据集表明PRMT7和SOX9高水平患者均显示出显著更差的OS，进一步支持了研究结果。

研究结论与意义

本研究通过筛选鉴定出PRMT7是SOX9的特异性精氨酸甲基转移酶。研究证实PRMT7在R160位点甲基化SOX9，从而拮抗KEAP1或FBXW7介导的泛素化和降解，进而稳定SOX9蛋白并促进NSCLC增殖。此外，研究确立了PRMT7-SOX9轴在体外和体内NSCLC进展中的关键作用，凸显其作为该恶性肿瘤有前景的治疗靶点。

蛋白质精氨酸甲基化由PRMTs催化，调节多种生理和病理过程，并日益被认为是包括癌症在内的多种人类疾病的关键因素。本研究筛选并鉴定出PRMT7是SOX9的特异性精氨酸甲基转移酶。研究证明PRMT7甲基化SOX9的R160残基，从而拮抗其由KEAP1或FBXW7介导的泛素化和降解，进而促进NSCLC增殖。此外，研究确立了PRMT7-SOX9轴在体外和体内NSCLC进展中的关键作用，凸显其作为有前景的治疗靶点。

SOX9是特征明确的致癌蛋白，在细胞命运决定、增殖和分化中起关键作用。其功能多样性受到翻译后修饰(PTM)的严格调控，深刻影响