METTL3/RBM15通过m6A修饰增强Kdm6b mRNA稳定性以促进STAT1介导的巨噬细胞活化及动脉粥样硬化

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：METTL3/RBM15 augments the stability of Kdm6b mRNA and promotes STAT1-mediated macrophage activation and atherosclerosis

本研究旨在阐明m6A修饰在动脉粥样硬化进程中巨噬细胞分化与活化中的调控作用。研究人员通过多组学分析发现，METTL3/RBM15复合物通过m6A修饰增强Kdm6b mRNA稳定性，进而促进KDM6B与JAK1相互作用并通过去甲基化激活JAK1-STAT1通路，驱动巨噬细胞炎症反应。单细胞测序与共培养实验证实KDM6B介导的巨噬细胞活化可增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）毒性，加速动脉粥样硬化进展。该研究揭示了m6A-KDM6B-STAT1轴在动脉粥样硬化中的关键作用，为靶向免疫代谢的疗法提供了新思路。

　　

心血管疾病是全球范围内的主要死亡原因，而动脉粥样硬化是其重要的病理基础。近年来，免疫炎症反应在动脉粥样硬化进展中的作用日益受到关注，其中巨噬细胞作为关键的免疫细胞，其分化、活化及与T细胞等免疫细胞的相互作用在疾病进程中扮演着核心角色。N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）是真核生物信使RNA中最常见的转录后修饰，由METTL3、METTL14、RBM15等“书写器”和FTO、ALKBH5等“擦除器”动态调控，参与调节RNA的稳定性、剪接、翻译和降解等过程。已有研究表明m⁶A修饰在巨噬细胞炎症反应、脂质摄取等方面发挥作用，并与动脉粥样硬化相关，然而，关于m⁶A修饰在单核细胞来源的巨噬细胞分化及其激活过程中的动态变化和系统性作用尚不清楚。同时，组蛋白去甲基化酶KDM6B（又称JMJD3）能够特异性去除组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K27me³），从而激活基因转录，在细胞分化、免疫应答等过程中发挥重要作用，但其在动脉粥样硬化中巨噬细胞活化过程中的调控机制，特别是是否受到m⁶A修饰的调控，仍有待阐明。

为了回答上述问题，研究人员在《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》上发表论文，系统描绘了巨噬细胞分化和激活过程中m⁶A修饰的动态图谱，并深入揭示了METTL3/RBM15-m⁶A-KDM6B轴通过调控JAK1-STAT1信号通路促进巨噬细胞活化及动脉粥样硬化进展的新机制。

本研究主要运用了以下关键技术方法：利用来自C57BL/6小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行体外培养和刺激；采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）进行多组学分析；通过蛋白质印迹（Western blot）、实时定量PCR（qPCR）、RNA免疫共沉淀（RIP）-qPCR、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光、流式细胞术等技术进行分子机制验证；构建巨噬细胞特异性Kdm6b基因敲除（CKO）小鼠模型并结合高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型进行体内功能研究；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析和共培养实验探讨细胞间相互作用。

动态变化在m⁶A谱在巨噬细胞分化过程中

研究人员首先使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导单核细胞分化为巨噬细胞，并在第0天、第3天和第5天进行了MeRIP-seq分析。结果显示，m⁶A修饰峰主要富集在mRNA的终止密码子附近。随着GM-CSF刺激时间的延长，m⁶A修饰的密度和含有m⁶A位点的mRNA数量均显著增加，且抑制m⁶A修饰会抑制巨噬细胞分化，表明m⁶A修饰对于巨噬细胞分化至关重要。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析发现，差异表达基因（DEGs）显著富集于免疫（如抗原加工与呈递、FcγR介导的吞噬作用、Toll样受体信号）、炎症（如JAK-STAT信号、TNF信号）以及分子加工（如泛素介导的蛋白水解、类固醇生物合成）等相关通路。进一步整合RNA-seq和MeRIP-seq数据的相关性分析显示，在巨噬细胞分化过程中，mRNA表达水平的变化与m⁶A修饰水平的变化呈负相关。这些结果表明m⁶A修饰广泛参与了巨噬细胞分化过程中的免疫活性重塑。

促炎通路和表观遗传酶在巨噬细胞激活过程中被m⁶A修饰特异性调控

为了探究巨噬细胞激活过程中m⁶A修饰的变化，研究人员对干扰素-γ（IFN-γ）刺激后的巨噬细胞进行了MeRIP-seq分析。与分化阶段不同，巨噬细胞激活并未显著改变整体的m⁶A修饰密度，但m⁶A修饰同样是IFN-γ诱导巨噬细胞活化所必需的。KEGG分析显示，IFN-γ刺激上调了PI3K-Akt信号和Toll样受体信号通路，而下调了PD-1/PD-L1检查点通路和FcγR介导的吞噬作用。值得注意的是，在巨噬细胞激活阶段，mRNA表达水平的变化与m⁶A修饰水平的变化呈现出正相关关系。细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号和MAPK信号通路在mRNA和m⁶A修饰水平上均受到一致调控。尤为引人注目的是，IFN-γ刺激特异性调控了一组与巨噬细胞成熟相关的基因（如Stat1、Cd86、Cxcl10和Cd274）以及一组表观遗传修饰酶（如Dot1l、Kdm6b、Kdm5b和Kmt2c）的表达。通过分析已发表的动脉粥样硬化斑块单细胞RNA测序数据，研究人员发现Kdm6b主要在髓系细胞中表达，且IFN-γ刺激显著增强了Kdm6b mRNA的m⁶A修饰并上调了其表达水平。这些发现提示，促炎通路和表观遗传酶KDM6B在巨噬细胞激活过程中受到m⁶A修饰的特异性调控。

KDM6B以去甲基酶活性依赖的方式促进STAT1磷酸化

为了验证KDM6B在巨噬细胞激活中的作用，研究人员使用KDM6B抑制剂GSKJ1处理巨噬细胞。结果显示，GSKJ1显著抑制了IFN-γ诱导的巨噬细胞脂质摄取和活性氧（ROS）产生。RNA-seq分析表明，与单独IFN-γ处理相比，GSKJ1处理减弱了IFN-γ诱导的FcγR介导的吞噬、扩张型心肌病和细胞外基质受体相互作用等相关通路的基因上调，并抑制了抗原呈递分子、趋化因子和胶原沉积相关基因的表达。METAFlux代谢通路分析进一步揭示，GSKJ1能够逆转IFN-γ诱导的多种小分子代谢和脂肪酸生物合成相关基因的上调。在分子水平上，GSKJ1处理或Kdm6b基因敲低均抑制了IFN-γ诱导的STAT1磷酸化，表明KDM6B对于STAT1的充分激活是必需的。

KDM6B通过去甲基化JAK1促进其磷酸化

由于未检测到KDM6B与STAT1之间的直接相互作用，研究人员将目光投向了JAK-STAT信号通路的上游激酶。实验证实，GSKJ1同样抑制了IFN-γ诱导的JAK1磷酸化。免疫共沉淀实验发现IFN-γ刺激显著增强了KDM6B与JAK1之间的相互作用。免疫荧光染色显示，一部分KDM6B蛋白在IFN-γ刺激后从细胞核转移至细胞质，并与JAK1发生共定位。更重要的是，IFN-γ刺激降低了JAK1的甲基化水平，同时诱导了其磷酸化，提示KDM6B可能通过去甲基化JAK1来促进其磷酸化激活。

IFN-γ诱导METTL3依赖的KDM6B mRNA m⁶A修饰

为了阐明调控Kdm6b mRNA m⁶A修饰的“书写器”，研究人员进行了RIP-qPCR实验。结果表明，在稳态条件下，METTL3和RBM15均能与Kdm6b mRNA结合。IFN-γ刺激后，METTL3与Kdm6b mRNA的结合增加，而RBM15的结合减少。抑制METTL3活性（而非敲低RBM15）能够消除IFN-γ诱导的Kdm6b mRNA m⁶A修饰，并降低其稳定性。进一步探索m⁶A修饰的下游效应，研究人员发现YTHDC1和YTHDC2能够与Kdm6b mRNA结合，并促进其在IFN-γ刺激下的稳定性。敲低Ythdc1会降低Kdm6b的mRNA和蛋白水平。对动脉粥样硬化斑块单细胞测序数据的MiloR分析显示，在疾病进展过程中，髓系细胞中Mettl3和Ythdc1/2的表达上调，而Kdm6b的表达下调，进一步支持了m⁶A修饰在体内调控Kdm6b的可靠性。

KDM6B依赖的巨噬细胞活化对CTL细胞毒性至关重要

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在动脉粥样硬化中发挥促进作用。单细胞测序分析发现，随着动脉粥样硬化进展，斑块内CTL中T细胞受体信号分子、细胞毒性相关分子和耗竭标志物的表达上调，表明CTL持续受到抗原刺激。差异基因表达分析显示，一个特定的巨噬细胞亚群（MC1）中抗原呈递机制相关基因（如Ciita、H2-K1）以及IFN-γ受体Ifngr1的表达增加。Connectome细胞间通讯分析提示MC1巨噬细胞与CTL之间的关联在动脉粥样硬化进程中增强。体外共培养实验证实，IFN-γ激活的巨噬细胞能够通过直接接触显著增强CTL的细胞毒性，而抑制KDM6B活性或阻断STAT1磷酸化则可逆转此效应。此外，KDM6B促进巨噬细胞诱导的CTL细胞毒性的能力依赖于STAT1磷酸化和CD80信号。这些结果说明巨噬细胞与CTL之间的相互作用对动脉粥样硬化的发展至关重要。

巨噬细胞特异性KDM6B缺陷延缓动脉粥样硬化

为了明确Kdm6b在巨噬细胞诱导的动脉粥样硬化中的作用，研究人员构建了在低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr^-/-）背景下的巨噬细胞特异性Kdm6b基因敲除（CKO）小鼠。与Ldlr^-/-小鼠和flox对照组相比，CKO小鼠的主动脉整体油红O染色和主动脉窦切片的苏木精-伊红（HE）染色显示动脉粥样硬化病变面积减小。Masson三色染色和天狼星红染色表明CKO小鼠斑块内胶原纤维积累减少。免疫组化染色显示CKO小鼠斑块内巨噬细胞浸润减少。流式细胞术分析进一步发现，巨噬细胞特异性敲除Kdm6b后，斑块内CTL的总比例及其活化状态（定义为PD1⁺CD107a⁺）均下降。有趣的是，系统性使用m⁶A修饰抑制剂STM2457同样能够延缓斑块形成、胶原积累以及巨噬细胞和CTL浸润。这些体内实验结果表明，巨噬细胞中的KDM6B通过促进CTL活化和IFN-γ依赖的巨噬细胞激活，部分地促进了动脉粥样硬化的进展。

本研究首次系统描绘了巨噬细胞分化和激活过程中m⁶A修饰的动态图谱，揭示了m⁶A修饰在调控巨噬细胞功能中的阶段特异性作用。研究结果表明，IFN-γ刺激通过METTL3介导的m⁶A修饰上调KDM6B的表达。KDM6B进而与JAK1相互作用，并通过其去甲基化活性促进JAK1磷酸化，从而激活JAK1-STAT1信号通路，驱动巨噬细胞的促炎活化。活化的巨噬细胞通过直接相互作用增强CTL的细胞毒性，共同促进动脉粥样硬化的发展。巨噬细胞特异性Kdm6b基因敲除或抑制m⁶A修饰均能在体内延缓动脉粥样硬化进程。该研究不仅阐明了m⁶A-KDM6B-STAT1轴在动脉粥样硬化中的关键作用，将表观转录组学调控与表观遗传酶的功能联系起来，而且为理解免疫细胞在动脉粥样硬化中的复杂相互作用提供了新的视角，为开发针对动脉粥样硬化的免疫代谢治疗策略提供了潜在的新靶点。