综述：二代测序技术在马尔尼菲篮状菌实验室诊断中的新进展

《Mycopathologia》：Emergence of Next-Generation Sequencing for Laboratory Diagnosis of Talaromyces marneffei

本综述系统回顾了二代测序（NGS）在马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei）感染诊断中的应用。文章指出，NGS凭借其无偏倚检测能力，在HIV阴性患者中显著提高了诊断率，并大幅缩短了诊断时间（中位2天 vs. 培养7天），已成为该病快速诊断的关键工具。

　　

引言：从竹鼠到人类，一种被低估的病原体

马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei）是东南亚地区最重要的致病性双相真菌，可引起系统性真菌病。该菌于1955年首次从实验室的中华竹鼠（Rhizomys sinensis）中分离出来，当时被命名为马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei）。直到2011年，基于系统发育分析，它才被重新归类为篮状菌属（Talaromyces）。该菌不仅是竹鼠及其洞穴土壤中的地方性动物病和环境储存库，也是该属中唯一被证实能在动物和人类中引起侵袭性感染的成员。

在历史上，马尔尼菲篮状菌感染几乎全部与人类免疫缺陷病毒（HIV）感染导致的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）相关，曾被视为艾滋病定义性机会性感染之一。然而，随着高效抗逆转录病毒治疗的应用和HIV/AIDS流行病的控制，临床实践中发现，越来越多的马尔尼菲篮状菌感染病例出现在非HIV感染的免疫抑制患者中，例如抗干扰素γ自身抗体、高IgE综合征、高IgM综合征等原发性免疫缺陷综合征，或器官移植、大剂量皮质类固醇治疗等继发性免疫缺陷状态。

诊断困境：非特异性表现与漫长的等待

马尔尼菲篮状菌感染的诊断极具挑战性，因为其临床表现通常极不典型。诊断过程往往需要临床医生具备丰富的经验和高度的怀疑，才能开具相应的实验室检查。在传统方法中，确诊依赖于从临床标本中分离真菌并证明其热双相性特征。然而，即使成功分离，通常也需要至少5天时间。虽然血清学诊断有用，但大多数实验室并未开展此类检测。

NGS的崛起：改变诊断范式的“无偏倚”工具

二代测序（NGS）技术的发展从根本上改变了感染性疾病的传统诊断方法。NGS能够对临床样本中存在的所有DNA进行测序，从而检测出所有病原体，包括细菌、真菌、DNA病毒和寄生虫。这种能力为实验室诊断提供了前所未有的价值。它不再绝对需要临床医生首先对某种疾病产生怀疑，即使在临床医生未怀疑马尔尼菲篮状菌感染的情况下，实验室也能通过NGS识别出包括马尔尼菲篮状菌在内的所有可能病原体。这种由NGS实现的新方法对于不明原因发热或其他培养阴性感染性疾病症状的患者尤为重要。

流行病学与NGS的新兴作用

首例通过NGS诊断的马尔尼菲篮状菌感染病例于2018年报告。自那时起，通过NGS检出的马尔尼菲篮状菌感染病例数量迅速增加，截至2024年12月31日，累计报告至少241例。大多数病例来自中国，这既反映了该感染在区域内的流行重要性，也反映了NGS在中国感染性疾病实验室诊断中的广泛应用。

在报告了人口统计学细节的病例中，男女比例约为4:1，中位年龄为43岁。在241名患者中，有136名（56.4%）为HIV阴性，这可能是临床医生最初未怀疑马尔尼菲篮状菌感染，最终只能通过NGS做出诊断的主要原因。在这136名HIV阴性患者中，有62名被证实存在其他形式的免疫缺陷，包括抗干扰素γ自身抗体（n=23）、肾或肝移植后免疫抑制治疗（n=22）、STAT3突变（n=4）、CD40LG突变（n=4）、CARD9突变（n=3）、STAT1突变（n=3）、IL12RB1突变（n=2）、TSC2突变（n=1）和IFNGR1突变（n=1）。

临床表现：极易误诊的“模仿大师”

在通过NGS诊断的马尔尼菲篮状菌感染患者中，受累的靶器官包括肺部（78.3%）、淋巴结（50.7%）、皮肤和软组织（20.3%）、肠道（11.6%）、骨骼（13.0%）、中枢神经系统（7.2%）等。

由于患者处于严重的免疫抑制状态，且临床表现通常非特异性，马尔尼菲篮状菌感染极易被误诊。由于结核病和马尔尼菲篮状菌感染都常表现为慢性肺炎综合征、非特异性全身感染或不明原因发热，且结核病的发病率远高于马尔尼菲篮状菌病，因此该病常被误诊为结核病。在本次综述中，至少有18名患者被临床诊断为结核病，其中13名患者因对抗结核治疗无反应或在治疗期间病情恶化而接受了NGS检测。

除了感染性疾病，至少还有11名最终通过NGS确诊的马尔尼菲篮状菌感染患者最初被误诊为良性或恶性肿瘤，最常见的是肺癌，其次是淋巴瘤、纵隔肿瘤和虹膜肿瘤。其中一例报告尤为典型，一名33岁男性因非特异性症状就诊，骨髓涂片镜检发现可疑的“利什曼-杜诺凡小体”，初步诊断为黑热病。然而，利什曼原虫抗体检测为阴性，随后的骨髓穿刺液NGS分析发现了马尔尼菲篮状菌的序列读数，而利什曼原虫的序列读数为零。重新分析骨髓涂片发现，之前观察到的可疑“利什曼-杜诺凡小体”实际上是马尔尼菲篮状菌的细胞内和细胞外嗜碱性酵母形态。

NGS的快速诊断优势：从数周缩短至数日

快速诊断对于开始正确治疗、避免使用不必要的抗菌药物以及采取必要的感染控制措施至关重要。在本次综述中，有19例病例报告了NGS结果生成所需的时间和真菌培养所需的时间。对于这19例病例，NGS检测马尔尼菲篮状菌的中位时间为2天（范围1-6天），显著短于真菌培养检测的中位时间7天（范围5-17天）（Mann-Whitney U检验，P<0.0001）。这一极小的P值表明，除了能发现难以诊断的马尔尼菲篮状菌感染病例外，NGS对于该病的快速诊断也至关重要。

NGS的共检测与结果解读挑战

由于NGS技术非常灵敏，除了目标病原体外，通常还会检测到其他微生物。在本次综述中，有93份样本提到了其他微生物的共检测。在这些样本中，中位检测到2种（范围1-21种）微生物。病毒是最常见的微生物群，其次是细菌和真菌。在病毒序列中，88%来自疱疹病毒，其中巨细胞病毒（40%）和EB病毒（34%）最为常见。在真菌序列中，72%来自酵母菌，其中超过一半（56%）是耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii），几乎是念珠菌属（29%）的两倍。

虽然检测到的部分微生物（如结核分枝杆菌、沙门氏菌和HIV-1）很可能是共病原体，但对大多数其他额外检测到的微生物序列的解释往往构成挑战，因为它们可能不是该特定患者的共病原体。例如，在一名38岁HIV阳性男性患者中，其肘关节液中同时检测到马尔尼菲篮状菌和沙门氏菌序列读数。由于从其血液和脑脊液样本中也分离出D群沙门氏菌，这支持了关节液中检测到的沙门氏菌序列读数可能代表了真正的感染。与所有其他微生物学检测一样，必须结合具体的临床背景谨慎解读NGS结果，以避免对患者进行不必要的抗菌药物过度治疗。

结语

自20世纪50年代发现以来，从临床样本中分离真菌并证明其热双相性特征和产生可扩散红色色素一直是马尔尼菲篮状菌感染相关实验室诊断的主要手段。随着20世纪80年代和90年代因HIV大流行导致临床病例激增，科学家们一直在寻找快速诊断工具以补充传统的真菌培养。近年来，NGS已成为马尔尼菲篮状菌病的一种有前景的诊断工具，特别是在发现HIV阴性患者病例和快速诊断方面。随着NGS平台的进一步改进和成本降低，以及更精简、用户友好的生物信息学分析工具的出现，预计NGS将在马尔尼菲篮状菌感染的快速诊断和管理中发挥前所未有的关键作用。