综述：靶向骨肉瘤免疫微环境以改善免疫疗法及转化应用

《Hormones & Cancer》：Targeting the osteosarcoma immune microenvironment for improved immunotherapy and translational applications

本综述系统阐述了骨肉瘤（OS）中高度免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）的复杂构成，重点分析了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）等关键免疫细胞在促进肿瘤进展和免疫治疗抵抗中的作用。文章深入探讨了免疫检查点抑制剂（ICIs）等现有免疫疗法疗效有限的机制，并展望了通过靶向TIME组分（如CAR-T细胞、巨噬细胞重编程等）以克服耐药性、改善临床预后的前沿策略与转化前景。

　　

骨肉瘤免疫抑制微环境的结构

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是好发于儿童和青少年的最常见原发性恶性骨肿瘤。尽管手术和化疗取得了进步，但转移性患者的预后仍然很差，五年生存率低于30%。这种治疗瓶颈凸显了对新策略的迫切需求。越来越多的证据表明，肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment, TIME）在OS的进展、转移和治疗抵抗中扮演着核心角色。

OS的TIME呈现出“免疫豁免”或“免疫荒漠”的表型，其特征是复杂的免疫细胞、基质成分和信号分子相互作用，共同营造了一个免疫抑制环境。髓系细胞驱动的抑制是其中的关键。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs），尤其是M2表型，是OS微环境中最丰富的免疫细胞，约占免疫细胞群的50%。这些M2-TAMs通过分泌白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎细胞因子，促进血管生成、细胞外基质（ECM）重塑和免疫逃逸。髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）在OS中尤其富集，特别是在转移灶中，它们通过产生活性氧、一氧化氮和精氨酸酶来削弱T细胞反应。

T细胞和自然杀伤（NK）细胞的功能障碍同样显著。效应T细胞虽然存在于OS病灶内，但表现出功能失调或耗竭的表型，高表达程序性死亡受体1（PD-1）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（TIM-3）等抑制性受体。同时，调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）被富集，进一步抑制免疫反应。因此，OS TIME呈现出高Treg/MDSC与CD8⁺T细胞比率，表明其“冷”肿瘤的免疫特征。NK细胞的功能也受到TGF-β等信号的抑制。

基质重塑和物理屏障也是免疫抑制的重要帮凶。癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）和间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）沉积致密的ECM，形成坚硬的骨样支架，物理性地阻碍免疫细胞浸润。在缺氧条件下，CAFs释放的IL-6和TGF-β进一步将TAMs极化为M2表型并扩增Tregs。

在信号通路层面，OS肿瘤劫持了多条炎症和免疫调节通路来维持抑制性TIME。STAT3的持续激活促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的产生。核因子κB（NF-κB）信号通路招募并极化TAMs和MDSCs，同时上调PD-1的配体（PD-L1）等免疫检查点。缺氧诱导因子（HIFs）诱导VEGF-C/D和CXCL12的表达，刺激血管生成和髓系细胞招募。

最近的单细胞RNA测序和空间转录组学分析开始揭示OS复杂的免疫景观和空间异质性。这些技术揭示了免疫群体之间的显著异质性，并识别出与生存结果相关的独特细胞邻域。例如，效应细胞与抑制性细胞之间更高的空间邻近性预示着更差的预后。这些空间和分子见解强调了在设计有效的OS免疫疗法时，考虑TIME结构而不仅仅是组成的重要性。

免疫检查点阻断在骨肉瘤中的应用

免疫检查点是抗肿瘤免疫的关键刹车，其配体/受体在OS中广泛失调。PD-1及其配体PD-L1是首要关注点。大约20-25%的原发性OS肿瘤细胞表达PD-L1，其表达与T细胞、树突状细胞和NK细胞的存在相关，表明PD-L1的上调是对免疫压力的适应性反应。OS转移灶中高的PD-1/PD-L1与较差的总体生存率密切相关。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）是另一个在OS患者T细胞（尤其是Tregs）上发现的抑制性受体。此外，TIM-3、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）和T细胞免疫受体Ig和ITIM结构域（TIGIT）等新兴检查点也在OS中被检测到，它们经常与PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞上共表达，导致T细胞耗竭。

尽管临床前证据令人鼓舞，但免疫检查点抑制剂在OS患者中显示出有限的疗效。在II期研究SARC028中，帕博利珠单抗（抗PD-1）治疗22例晚期OS患者，仅有1例出现客观反应。伊匹木单抗（抗CTLA-4）在儿科OS患者中也未显示出临床获益。这些试验表明，单药ICI在OS中几乎不能引起肿瘤缩小。

对ICI的抵抗机制是多方面的。检查点表达的异质性是一个障碍。OS具有中等的突变负荷，但强效新抗原相对有限，导致许多OS肿瘤对T细胞“不可见”。免疫豁免的TIME是另一个主要机制。致密的骨样ECM物理性阻碍T细胞浸润。即使T细胞存在，免疫抑制细胞（TAMs、MDSCs、Tregs）也占主导地位，并分泌抑制性介质。代谢物如腺苷和乳酸的积累为T细胞创造了代谢上敌对的微环境。高水平的TGF-β驱动纤维化并直接抑制细胞毒性淋巴细胞。

为了提高ICI疗效，联合策略正在开发中。放疗和某些化疗药物可以通过免疫原性细胞死亡将肿瘤转化为免疫中心。在临床前OS模型中，放疗联合PD-1/CTLA-4阻断显著增加了CD8⁺T细胞浸润并减少了Tregs。抗血管生成药物可通过血管正常化增强T细胞进入。重编程抑制细胞也是一个关键焦点，例如使用集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂使TAMs向促炎状态转变，或使用CXCR4拮抗剂阻断MDSC的运输。

三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）等生物标志物正在被研究其预测价值。在晚期OS病例中检测到TLS的患者，其中位无进展生存期优于缺乏TLS的患者。这表明TLS的存在可能预测ICI获益，促进TLS形成或可增强OS的免疫治疗效果。

重编程骨肉瘤免疫微环境

基于T细胞的治疗策略，如嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-cells, CAR-T）疗法，已被扩展到OS抗原。已识别的靶点包括神经节苷脂GD2、人表皮生长因子受体2（HER2）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）等。GD2-CAR-T细胞在体外对OS细胞系显示出强大的细胞毒性，一项I期试验证明了其在OS患者中的安全性。然而，CAR-T在OS中的疗效受到向骨病变部位归巢能力差和抗原丢失的限制。克服策略包括为CAR-T“装甲化”细胞因子支持，或使用双特异性构建体。

巨噬细胞导向疗法代表了少数进入III期临床测试的OS免疫策略之一。原型药物米法穆肽通过NOD2信号激活单核细胞，选择性清除肿瘤细胞。关键试验显示，米法穆肽联合标准化疗可改善可切除非转移性OS的总生存期，但无事件生存期终点未达到，这导致了欧洲药品管理局的批准，但未获美国FDA认可。同时，针对CD47-SIRPα轴（一种“别吃我”信号）的阻断剂，如马格罗利单抗，在临床前模型中可增强巨噬细胞对OS细胞的清除并抑制肺转移。从转移的角度看，肿瘤细胞表达血管细胞粘附分子1（VCAM-1）有助于其与肺巨噬细胞粘附，促进转移定植，针对VCAM-1的单克隆抗体旨在破坏这种相互作用。

基于树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）的策略也在研究中。瘤内给予Toll样受体或干扰素基因刺激蛋白激动剂可以激活驻留的DC，增强抗原呈递和T细胞启动。将CD103⁺常规树突状细胞疫苗接种与CTLA-4抑制相结合，在临床前研究中导致了肿瘤的完全消退。

提升免疫浸润

大约75%的骨肉瘤显示有T细胞和巨噬细胞浸润，但这并不总能转化为有效的抗肿瘤反应。细胞毒性CD8⁺T细胞与FOXP3⁺Tregs的比率较高与显著改善的预后相关，强调了免疫平衡在OS肿瘤控制中的重要性。利用这种免疫潜力的努力集中在非抗原特异性和抗原特异性策略上。从手术标本中提取、体外扩增后再回输肿瘤浸润淋巴细胞是一种有前景的方法。同样，基于NK细胞的疗法，包括CAR-NK细胞，作为T细胞导向免疫疗法的替代方案正在出现，它们具有识别应激诱导配体的能力，且不依赖于抗原特异性。

佐剂和新抗原方法

新抗原疫苗和重塑TIME的佐剂策略也在研究中。溶瘤细菌可以触发先天免疫并启动T细胞。STING或TLR激动剂的瘤内给药可诱导I型干扰素级联反应，增强抗原呈递。一项评估地西他滨联合靶向MAGE-A1、NY-ESO-1和MAGE-A3的树突状细胞疫苗的I期研究在神经母细胞瘤和肉瘤患者中显示出良好的安全性，但其疗效尚不确定。

转化影响与未来方向

对OS TIME的多组学解析正在从根本上重塑治疗范式。高维研究揭示了患者亚组，可用于分层治疗。整合单细胞RNA测序、空间蛋白质组学和T细胞受体库测序可以绘制抗肿瘤克隆型和耗竭状态，从而指导个性化免疫疗法。将多组学见解转化为可操作的临床生物标志物仍处于早期阶段。OS的罕见性和异质性使患者分层复杂化并限制了试验的可扩展性。展望未来，OS的精准免疫治疗设计可能涉及分析每个肿瘤的TIME、突变组和基质组成，从而实现合理的组合治疗。先进技术的采用将促进这些见解的转化，最终通过将免疫微环境从敌人转变为朋友，提供多模式、基于机制和个性化的治疗。