基于肠球菌来源BoNT样蛋白轻链的SNAP-23靶向切割特性表征与工程化改造潜力分析

《Journal of Neural Transmission》：Characterisation of the SNAP-25 and SNAP-23 cleavage properties of the botulinum neurotoxin-like protein from Enterococcus

本研究旨在解决传统肉毒毒素（BoNT）无法有效切割非神经元分泌关键蛋白hSNAP-23的难题。研究人员系统表征了肠球菌来源BoNT样蛋白轻链（LC/En）的底物特异性，发现其虽对SNAP-25的切割效率低于LC/A，但对hSNAP-23的活性却高出LC/A 100倍以上。通过定点突变分析，研究揭示了hSNAP-23中Lys-49和Asn-53是影响LC/En切割效率的关键位点，为后续工程化改造LC/En以开发靶向hSNAP-23的新型生物制剂奠定了理论基础。

　　

在生物医学领域，肉毒毒素（Botulinum Neurotoxin, BoNT）早已不是陌生的名字。这种由肉毒梭菌产生的剧毒物质，因其能精准阻断神经递质释放，摇身一变成为治疗肌肉痉挛、多汗症乃至美容除皱的明星药物。然而，科学家们并不满足于此，他们正致力于将这种“毒素”的威力拓展到更广泛的疾病治疗中，例如慢性炎症、哮喘等由非神经元细胞过度分泌引发的疾病。

要实现这一目标，一个关键障碍在于，传统的BoNT主要靶向神经元中的SNARE蛋白（如SNAP-25），而对非神经元细胞中广泛表达、功能类似的SNAP-23蛋白却几乎“视而不见”。SNAP-23是调控炎症因子等物质释放的关键蛋白，若能开发出能有效切割SNAP-23的新型毒素，无疑将为治疗相关疾病打开一扇新的大门。

近年来，科学家们在肠球菌（Enterococcus faecium）中发现了一种BoNT样蛋白（BoNT/En），其轻链（LC/En）被报道能够切割SNAP-23。这为开发新型SNAP-23靶向药物提供了一个极具潜力的起点。那么，这个来自肠球菌的LC/En，其切割SNAP-23的能力究竟有多强？它是否比经过人工改造的BoNT轻链更具优势？为了回答这些问题，来自德国汉诺威医学院的研究团队在《Journal of Neural Transmission》上发表了他们的最新研究成果。

主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 重组蛋白表达与纯化：利用大肠杆菌系统表达并纯化了LC/En以及一系列SNAP-25和hSNAP-23的截短体及突变体蛋白。2. 体外转录/翻译：通过体外转录/翻译系统，结合放射性同位素³⁵S-甲硫氨酸标记，制备了全长的SNAP-25A、SNAP-25B和hSNAP-23蛋白。3. 体外内肽酶活性测定：通过体外切割实验，评估LC/En对不同底物的切割效率，并通过SDS-PAGE和磷屏成像或考马斯亮蓝染色进行定量分析。4. 定点突变与丙氨酸扫描：对hSNAP-23和SNAP-25B进行系统性定点突变，以鉴定影响LC/En切割效率的关键氨基酸位点。5. 蛋白质结构分析：利用同源建模和已解析的晶体结构，分析LC/En的活性中心结构及其与底物的相互作用。

研究结果

SNAP-25和SNAP-23A对LC/En蛋白水解的敏感性

研究人员首先比较了LC/En对小鼠SNAP-25A、SNAP-25B以及人源SNAP-23（hSNAP-23）的切割效率。结果显示，LC/En对SNAP-25B的切割效率略高于SNAP-25A，其EC₅₀值约为10-20 nM。相比之下，LC/En对hSNAP-23的切割效率要低得多，其EC₅₀值约为500 nM，比SNAP-25高出约25倍。然而，与传统的BoNT/A轻链（LC/A）相比，LC/En对hSNAP-23的活性却表现出巨大优势。在相同实验条件下，LC/A对hSNAP-23的切割活性极低，其EC₅₀值估计高达50 μM。这意味着LC/En对hSNAP-23的切割活性比LC/A高出100倍以上。这一结果表明，尽管LC/En对hSNAP-23的天然活性仍有待提高，但它确实是一个比LC/A更优越的工程化改造起点。

LC/En最小底物需求的确定

为了阐明LC/En对hSNAP-23敏感性较低的原因，研究人员首先确定了其切割SNAP-25所需的最小底物区域。通过构建一系列C端和N端截短的SNAP-25突变体，他们发现，包含裂解位点（Lys-69-Asp-70）及其两侧各约24个氨基酸的区域，足以保证LC/En的有效切割。这一发现为后续的定点突变分析划定了关键的研究范围。

LC/En相互作用底物残基的鉴定

接下来，研究人员对hSNAP-23中上述关键区域的26个氨基酸进行了丙氨酸扫描突变分析。结果发现，有9个位点的突变会显著降低LC/En的切割活性，其中Glu-47、Glu-50、Asn-63、Asp-65和Met-66的突变影响尤为显著，表明这些残基的侧链参与了底物与酶之间的相互作用。特别值得注意的是，将hSNAP-23中的Lys-49突变为甘氨酸（SNAP-25中对应位置的氨基酸）后，切割效率提高了一倍。更令人惊喜的是，将Asn-53突变为天冬氨酸（SNAP-25A对应位置）或谷氨酸（SNAP-25B对应位置）后，切割效率分别提高了3倍和4倍以上。这些数据表明，hSNAP-23中Lys-49和Asn-53这两个位点的氨基酸差异，是导致其被LC/En切割效率低于SNAP-25的主要原因。

LC/En催化机制的表征

为了确认LC/En是否遵循经典的BoNT催化机制，研究人员分析了其活性中心的关键氨基酸。结构比对显示，LC/En中负责催化Zn²⁺配位和稳定过渡态的氨基酸（如Arg-364和Tyr-367）与LC/A中的对应氨基酸高度保守。功能实验证实，将Arg-364突变为丙氨酸会严重削弱LC/En的催化活性，而双突变体R364A/Y367F的活性则几乎完全丧失。这些结果证明，LC/En确实是一种典型的BoNT家族锌蛋白酶。

研究结论与讨论

本研究系统地表征了肠球菌来源BoNT样蛋白轻链（LC/En）的底物切割特性。研究证实，LC/En是一种遵循经典BoNT催化机制的锌蛋白酶，其活性中心的关键氨基酸与已知的BoNT轻链高度保守。

尽管LC/En对SNAP-25的切割效率低于LC/A，但它对hSNAP-23的天然活性却远超LC/A，这使其成为开发靶向hSNAP-23新型药物的一个极具潜力的起点。通过系统的定点突变分析，研究揭示了hSNAP-23中Lys-49和Asn-53这两个关键位点，它们位于裂解位点上游约12-16个氨基酸处，其氨基酸差异是导致LC/En对hSNAP-23切割效率低于SNAP-25约25倍的主要原因。

这一发现具有重要的指导意义。它表明，通过理性设计或定向进化技术，对LC/En中与hSNAP-23的Lys-49和Asn-53相互作用的结合口袋进行改造，有望显著提高其对hSNAP-23的切割活性。一旦成功，这种经过优化的LC/En便可以作为核心组件，与靶向非神经元细胞的递送载体（如靶向分泌抑制剂TSI或SNARE标记技术）结合，开发出能够精准抑制非神经元细胞过度分泌的新型生物制剂，为治疗慢性炎症、哮喘等疾病提供全新的治疗策略。