单细胞测序揭示ZBP1通过CCL7-CCR1轴介导CAF-肿瘤细胞通讯促进口腔鳞癌进展

《Cell Death & Disease》：Single-cell RNA sequencing identifies ZBP1-dependent mechanisms in OSCC progression

本研究旨在解决口腔鳞癌（OSCC）中肿瘤微环境（TME）调控机制不清的问题。研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，揭示了Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）在OSCC中的促癌作用。研究发现，ZBP1通过调控癌症相关成纤维细胞（CAFs）分泌CCL7，进而激活肿瘤细胞上的CCR1受体，形成CAF-肿瘤细胞通讯轴，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。该研究为靶向ZBP1-CCL7-CCR1轴治疗OSCC提供了新的理论依据和潜在策略。

　　

口腔鳞癌（OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其侵袭性强、易复发转移，导致患者5年生存率长期徘徊在40%-50%的低水平。这种严峻的预后，很大程度上归咎于其复杂的肿瘤微环境（TME）。在TME中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）作为最丰富的基质细胞成分，扮演着“帮凶”的角色。它们通过重塑细胞外基质、分泌多种细胞因子和趋化因子，为肿瘤细胞的生长、迁移和免疫逃逸提供了肥沃的“土壤”。因此，深入解析CAFs与肿瘤细胞之间的“对话”机制，对于开发新的OSCC治疗策略至关重要。

Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）是一种模式识别受体，因其能特异性识别Z构象的核酸而得名。近年来，ZBP1在肿瘤免疫调节中的作用逐渐受到关注。它不仅能识别病原体，还能通过其C端的RIP同型相互作用基序（RHIM）与受体相互作用蛋白激酶（RIPK1/3）形成信号复合物，启动程序性细胞死亡级联反应，甚至触发一种整合了焦亡、凋亡和坏死性凋亡特征的炎症性程序性细胞死亡——PANoptosis。这些功能使得ZBP1能够广泛影响TME，调控基质细胞功能、炎症反应和免疫逃逸，从而在肿瘤的发生发展中扮演着复杂而关键的角色。然而，ZBP1在OSCC中的具体作用及其分子机制尚不明确。

为了填补这一空白，南京医科大学附属淮安第一医院、南京医科大学附属口腔医院等机构的研究团队在《Cell Death & Disease》杂志上发表了一项题为“Single-cell RNA sequencing identifies ZBP1-dependent mechanisms in OSCC progression”的研究。该研究首次系统性地揭示了ZBP1在OSCC中的促癌功能，并阐明了其通过调控CAFs分泌趋化因子CCL7，进而激活肿瘤细胞上的CCR1受体，从而驱动OSCC进展的分子机制。

研究方法概览

为了探究ZBP1在OSCC中的作用，研究人员首先通过分析公共数据库（TCGA、GEO）确认了ZBP1在头颈部鳞癌（HNSCC）组织中的高表达。随后，他们构建了Zbp1基因敲除（Zbp1^-/-）小鼠，并利用两种经典的OSCC模型进行验证：一是将小鼠口腔鳞癌细胞系MOC-1原位移植到小鼠舌部（异位移植模型），二是通过4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）饮水诱导自发OSCC模型（化学诱导模型）。通过比较野生型（WT）和Zbp1^-/-小鼠的肿瘤生长情况，评估ZBP1缺失对OSCC进展的影响。

为了深入解析ZBP1缺失后肿瘤微环境的变化，研究人员对WT和Zbp1^-/-小鼠的肿瘤组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。通过Seurat、Monocle2、CellPhoneDB等生物信息学工具，他们系统分析了细胞异质性、细胞发育轨迹以及细胞间的通讯网络。

在体外功能验证方面，研究人员利用肿瘤条件培养基（TCM）诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）转化为CAFs，并通过CRISPR-Cas9技术构建了ZBP1敲低的CAFs。通过Transwell共培养、EdU增殖、划痕愈合等实验，结合CCR1抑制剂（BX471）和外源性重组CCL7蛋白的干预，验证了ZBP1-CCL7-CCR1信号轴在调控肿瘤细胞恶性表型中的功能。

最后，研究人员在体内通过腹腔注射CCR1抑制剂BX471和外源性重组CCL7蛋白，进一步验证了该信号轴在OSCC进展中的关键作用。

研究结果

ZBP1在HNSCC中高表达，其缺失抑制OSCC肿瘤生长

研究人员首先通过分析TCGA-HNSCC数据库和GEO数据集，发现ZBP1在HNSCC组织中的mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织。为了验证ZBP1的功能，他们构建了Zbp1^-/-小鼠模型。在MOC-1细胞原位移植模型中，Zbp1^-/-小鼠的肿瘤体积显著小于野生型（WT）小鼠，且体重下降幅度更小。在4NQO诱导的自发OSCC模型中，Zbp1^-/-小鼠的肿瘤负荷也显著降低，且病理学观察发现其病变多为轻中度上皮异型增生，而WT小鼠则普遍发展为浸润性癌。免疫组化结果显示，Zbp1^-/-肿瘤组织中增殖标志物Ki-67和Wnt信号通路关键分子β-连环蛋白（β-catenin）的表达均下调。这些结果共同表明，ZBP1缺失能够有效抑制OSCC的恶性进展。

单细胞测序揭示ZBP1缺失导致肿瘤细胞转录组重编程

为了深入探究ZBP1调控OSCC进展的机制，研究人员对WT和Zbp1^-/-小鼠的肿瘤组织进行了单细胞RNA测序。通过UMAP降维聚类和细胞类型注释，他们成功鉴定了13种主要的细胞亚群，包括中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、血管内皮细胞、上皮细胞（肿瘤细胞）等。

对肿瘤细胞的分析发现，Zbp1^-/-肿瘤细胞与WT肿瘤细胞在转录组水平上存在显著差异。基因集变异分析（GSVA）显示，Zbp1^-/-肿瘤细胞中与增殖相关的通路（如E2F靶点、MYC靶点、细胞周期）显著下调，而与免疫激活（如干扰素反应、IL-6-JAK-STAT3信号、TNF-α-NF-κB信号）和应激反应（如p53信号通路）相关的通路则显著上调。基因集富集分析（GSEA）和KEGG富集分析进一步证实，Zbp1^-/-肿瘤细胞中细胞周期、糖酵解等代谢通路被抑制，而TGF-β信号通路、FoxO信号通路等应激适应通路被激活。

转录因子调控网络（SCENIC）分析显示，Zbp1^-/-肿瘤细胞中IRF8、IRF5、KLF2等与免疫监视和细胞死亡相关的转录因子活性增强，而WT肿瘤细胞中E2F4、ETV4等促增殖转录因子活性更高。伪时间轨迹分析（Pseudotime trajectory analysis）进一步揭示，WT肿瘤细胞主要富集在早期发育状态，而Zbp1^-/-肿瘤细胞则更倾向于富集在终末状态，其基因表达模式与应激反应、受体信号通路和分化相关过程相关。这些结果表明，ZBP1缺失导致肿瘤细胞从增殖侵袭状态向应激适应和免疫激活状态转变，从而限制了肿瘤的生长。

细胞互作网络分析揭示ZBP1通过CCL7-CCR1轴介导CAF-肿瘤细胞通讯

为了探究ZBP1如何调控肿瘤微环境中的细胞间通讯，研究人员利用CellPhoneDB分析了细胞间的配体-受体相互作用网络。结果显示，在OSCC微环境中，肿瘤细胞与CAFs之间的通讯网络最为活跃。进一步分析发现，ZBP1缺失显著减弱了CAFs与肿瘤细胞之间的CCL7-CCR1信号轴。

免疫组化和ELISA实验证实，Zbp1^-/-小鼠肿瘤组织中CCL7的表达和分泌水平均显著降低。免疫荧光双标染色进一步显示，CCL7主要表达于α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的CAFs中，且Zbp1^-/-小鼠肿瘤组织中CCL7⁺/α-SMA⁺共定位区域显著减少。这些结果表明，ZBP1通过调控CAFs分泌CCL7，从而介导了CAF与肿瘤细胞之间的通讯。

体外功能验证：ZBP1通过调控CAF分泌CCL7促进肿瘤细胞恶性表型

为了验证上述发现，研究人员在体外利用肿瘤条件培养基（TCM）成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）转化为具有CAF特征的细胞（表达α-SMA、FAP、COL1A1等标志物）。这些诱导的CAFs能够分泌高水平的CCL7，并能显著促进MOC-1肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖。

通过CRISPR-Cas9技术敲低CAFs中的ZBP1后，CAFs分泌CCL7的能力显著下降。当MOC-1细胞与ZBP1敲低的CAFs共培养时，其迁移、侵袭和增殖能力均受到抑制。更重要的是，这种抑制作用可以被外源性重组CCL7蛋白所逆转。此外，使用CCR1的特异性抑制剂BX471处理，也能有效阻断CAFs对MOC-1细胞恶性表型的促进作用。这些体外实验结果表明，ZBP1通过调控CAFs分泌CCL7，进而激活肿瘤细胞上的CCR1受体，从而促进肿瘤细胞的恶性行为。

体内验证：靶向CCL7-CCR1轴可逆转ZBP1缺失的抑癌效应

为了在体内验证ZBP1-CCL7-CCR1轴的功能，研究人员在MOC-1原位移植模型中进行了一系列干预实验。结果显示，在WT小鼠中，腹腔注射CCR1抑制剂BX471能够显著抑制肿瘤生长；而在Zbp1^-/-小鼠中，腹腔注射外源性重组CCL7蛋白则能够部分恢复肿瘤的生长。组织学分析进一步证实，BX471处理下调了WT肿瘤中Ki-67、β-catenin和CCR1的表达，而外源性CCL7则上调了Zbp1^-/-肿瘤中这些分子的表达。这些体内实验数据有力地证明了ZBP1通过CCL7-CCR1轴在OSCC进展中发挥关键的促癌作用。

结论与讨论

本研究首次系统性地揭示了ZBP1在OSCC中的促癌功能及其分子机制。通过整合单细胞转录组学、基因敲除小鼠模型以及体外功能实验，研究人员发现ZBP1缺失能够重塑肿瘤微环境，抑制肿瘤细胞的增殖和代谢，并激活免疫应激反应，从而抑制OSCC的进展。

研究的核心发现是，ZBP1作为CAF与肿瘤细胞之间通讯的关键桥梁，通过调控CAFs分泌趋化因子CCL7，进而激活肿瘤细胞上的CCR1受体及其下游信号通路（如MAPK、NF-κB、AKT），最终促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这一发现不仅揭示了ZBP1在OSCC中的新功能，也阐明了CCL7-CCR1轴在OSCC进展中的重要作用。

该研究为理解OSCC肿瘤微环境的复杂性提供了新的视角，并提示靶向ZBP1-CCL7-CCR1信号轴可能成为治疗OSCC的潜在新策略。然而，该研究也存在一些局限性，例如结论主要基于小鼠模型和细胞系，其在人类OSCC中的普适性仍需进一步验证。此外，ZBP1在免疫细胞中的功能以及该信号轴在其他肿瘤类型中的作用，也是未来值得深入探索的方向。