手术切口边缘的纵向转录组与空间基因谱分析揭示术后疼痛与组织修复的关键信号通路

《Communications Biology》：Longitudinal human transcriptomic and spatial gene profiling at the incisional edge during long surgical procedures

本研究针对术后疼痛管理过度依赖阿片类药物及其成瘾风险问题，通过纵向采集人类手术切口边缘组织，结合RNA-Seq和多重荧光原位杂交技术，揭示了IL-6、OSM、LIF等关键细胞因子在皮肤结构（如毛囊、汗腺）中的诱导表达模式，并证实其受体在背根神经节神经元上的表达，构建了组织损伤与感觉神经元之间的"相互作用组"，为开发非阿片类镇痛靶点提供了新方向。

　　

手术是治疗疾病的重要手段，但术后疼痛却成为困扰患者的一大难题。在过去二十年中，术后急性疼痛主要依靠强效阿片类药物进行管理，这不仅与阿片类药物误用和使用障碍相关，还可能导致约10%的患者发展为慢性术后疼痛，严重影响生活质量。因此，实现不依赖阿片类药物的术后疼痛控制，并深入理解术后疼痛的病因和演变过程以设计预防策略，成为当前研究的两个主要目标。

组织损伤在手术过程中释放的炎症介质被认为是刺激和致敏伤害性感受器，导致疼痛的关键因素。致敏的伤害性感受器可能表现为自发性活动、反应阈值降低、对超阈值刺激的反应增强以及感受野扩大等特征，这些都与术后疼痛密切相关。这一过程部分是由于伤害性感受末梢浸泡在复杂的损伤相关分子模式混合物中，包括来自损伤组织的炎症介质和直接感知受损细胞释放的分子如ATP。

尽管先前在大鼠模型中的研究为早期信号响应提供了见解，但由于啮齿动物与人类在伤口愈合策略和皮肤特征上的显著差异，这些结果在人类中的相关性有限。这凸显了将研究成果扩展到人类手术组织样本以确保人类相关性的重要性。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，研究人员开展了一项创新性工作，通过在长时间手术（≥4小时）中纵向采集人类切口边缘组织样本，系统分析了手术损伤后早期的分子变化。研究团队在手术过程中多个时间点（0小时、1小时、2小时、4小时、6小时以及≥8小时时的伤口闭合时）收集皮肤组织样本，并采用RNA测序和多重荧光原位杂交等技术，深入探索了组织损伤引发的转录组变化和空间基因表达模式。

关键技术方法包括从12名接受胸部和/或腹部手术的患者身上纵向采集切口边缘组织，进行RNA提取和高通量测序；使用多重荧光原位杂交技术对皮肤和背根神经节组织进行空间基因表达定位；通过生物信息学工具如Enrichr和STRING进行通路分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络构建；利用imsig算法估计免疫细胞丰度；以及通过免疫组织化学方法验证特定蛋白的表达。

患者报告的疼痛结局

研究首先评估了患者手术前后的疼痛状况。参与者术前疼痛评分较低，表明他们进入研究时仅有轻度或无疼痛。术后，患者报告的疼痛强度从基线的1.7±0.6上升至术后第一天和第二天的4.3±0.5，疼痛干扰也从2.0±0.9增加至6.4±0.8和5.7±0.8，表明患者经历了中度至重度疼痛。尽管标准疼痛管理提供了一定缓解（术后第一天72%，第二天76%的缓解率），但疼痛仍然显著。McGill疼痛量表评估显示，术后疼痛最常见的情感成分是疲劳-精疲力竭（91%）和恶心（68%），而感觉模态描述词中高度代表性的是酸痛（86.36%）、痉挛（68.18%）、触痛（72.73%）、沉重（54.55%）和锐痛（59.09%）。

组织采集方案概述

研究设计了一套微创皮肤采集程序，在每个指定时间点使用手术刀切除单个24毫米长的活检组织，并将其分为三部分：一部分用于RNA测序分子分析，第二部分用于组织学分析，第三部分用于脂质组学分析（本报告未包括）。这种方法确保了样本的一致性和可比性。

手术过程中皮肤基因表达的整体模式

RNA测序在总共63个样本上进行，平均每个样本读取7110万条读数。差异表达基因分析显示，相对于零时间点对照，每个时间点都有大量基因表达发生显著变化。在整个过程中，显著增加的独特基因总数为1163个，而显著减少的基因在6小时和闭合时间点达到4777个，远多于增加的基因数量。值得注意的是，4小时时间点是DEGs检测的显著转折点，此时检测到的DEGs数量急剧增加。

聚类分析确定，大多数基因在整个采样时间过程中持续增加或减少，通常不显示明显的时间模式。增加和减少基因的平均轨迹通过绘制所有增加或减少DEGs的归一化形状来创建，两者都显示线性形状。在增加的DEGs中，白细胞介素6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，也称为CCL2）是幅度最高的增加DEGs之一。角质蛋白16（KRT16）作为一个中等程度增加基因的例子，其基础表达相对较高，且与伤口愈合相关。在减少的基因中，D-box结合PAR bZIP转录因子（DBP）和Gypsy逆转录转座子整合酶1（GIN1）是两个在数据集中强烈减少的DEGs，它们之前未与伤口愈合相关。此外，瞬时受体电位香草素1（TRPV1）作为一个中等程度减少基因的例子，突出了这个已知的DRG热感觉通道在皮肤功能中的新兴作用。

切口诱导的高显著性分泌因子的鉴定和通路分析

在分析之前，研究人员检查了性别差异对基因表达的潜在影响，结果显示男性和女性对切口反应无显著差异。随后的分析是在不考虑性别的情况下对男性和女性参与者进行合并分析。

从1163个显著增加的基因中提取并分类后，研究发现切口后强烈诱导的主要基因是IL-6细胞因子家族基因，包括IL-6（775.1倍）、CSF3（772.6倍）和OSM（30.8倍），以及CXC趋化因子，包括IL-8（377.9倍）、CXCL2（174.0倍）和CXCL1（49.4倍）。另一个涉及金属硫蛋白家族基因的小类别也显示出高表达水平。金属硫蛋白2A是数据集中表达最高的增加DEG，从基线的231.32 sFPKM达到最高表达水平6611.5 sFPKM，增加了2758.16%。

鉴于分泌因子的诱导在不可知论分析中非常突出，研究进一步特异性评估了编码分泌蛋白的转录本。通过将总显著基因列表分类为功能性和/或药理学可靶向类别来实现这一目标，包括分泌蛋白、细胞组分和受体。在编码分泌蛋白的基因（84个基因）中，通过诱导倍数比绘制前50个基因的热图。显著诱导基因的个体sFPKM图，包括IL-6、IL-8、OSM和OSMR。

使用定量通路分析工具理解基因表达变化

Enrichr被用于识别诱导基因中广泛显著的通路。鉴定出的首要通路是"白细胞介素-1对细胞外基质的调节"，在每个检查的时间点都非常显著。还鉴定出几个其他白细胞介素通路，表明白细胞介素信号传导是细胞对切口反应的一个突出特征。制瘤素M信号传导在每个检查的时间点也被鉴定为高度显著，表明制瘤素M信号传导增加。

相比之下，使用这种方法，减少基因显示很少或没有一致的通路调节，主要显著通路是"通用转录"，符合转录随时间减少的观点，可能是由创伤导致。由于显著减少基因中普遍缺乏模式，研究主要关注增加基因。

重要的是，通路分析并不完美，因为通常基因通路可能相互关联，而这些分析未能完全捕捉到这一点。为了解决这个问题，对前100个显著增加基因进行了STRING分析，表明前100个基因在功能上高度互连。这与一些最显著基因通路的相似性一致，表明在大多数情况下，主要的基因调控模式在术后占主导地位，个体通路可能相互关联。

中性粒细胞浸润是早期损伤免疫反应的主要组成部分

在啮齿动物的后爪切口模型中，第一个免疫招募事件发生在切口后4-6小时，当中性粒细胞被招募到伤口部位。现有文献、大体组织学以及一些显著基因如CD177、S100A8和S100A9都提示早期中性粒细胞浸润，与损伤免疫反应的第一阶段一致。

使用钙卫蛋白抗体，在大多数样本中观察到靠近伤口边缘的中性粒细胞富集，并在整个手术过程中稳定增加。值得注意的是，在人类皮肤中，使用原位杂交，S100A8和S100A9也标记表皮细胞，特别是毛囊附近的表皮细胞，这与相对特异性针对中性粒细胞的蛋白质染色形成对比。

中性粒细胞出现在血管腔内，并且经常在血管附近观察到血管周围间质中性粒细胞，提示跨壁迁移。中性粒细胞经常浸润结构，如毛囊或大范围的脂肪。展示了中性粒细胞浸润大块皮下脂肪的例子。

为了解决各种浸润免疫细胞的存在问题，基于现有文献检查了标记基因。对于中性粒细胞，一些最特异的标记基因如CD177显著增加，遵循与S100A9相同的模式。通常，超过一半的中性粒细胞面板基因增加。相比之下，虽然IL-8和ITGAX与巨噬细胞相关，但更特异的标记基因面板通常显示无变化。确实，设计用于检查巨噬细胞、肥大细胞或T细胞的面板未显示明显增加，尽管相对较少特定的肥大细胞基因，且批量组织转录组学在检查细胞类型特异性变化方面存在局限性。

另一种测量方法是使用计算包imsig来量化随时间变化的免疫细胞特征。这种方法使用经过验证的标志物面板来估计组织样本中细胞类型的丰度。imsig分析证实了中性粒细胞是唯一增加的免疫细胞类型，而其他主要免疫细胞类型没有增加。此外，imsig表明增殖和翻译的广泛通路减少，这可以解释大量相对非特异性减少的DEGs。值得注意的是，高度诱导的基因IL-6参与免疫细胞迁移，在内皮细胞中诱导最强，强调在某些情况下免疫信号传导涉及多种细胞类型。

皮肤和DRG神经元群体中制瘤素M和制瘤素M受体基因表达的评估

使用多重荧光原位杂交解决了OSM和OSMR转录本在皮肤中的定位。先前的研究表明OSM-OSMR信号传导具有多效性功能，包括疼痛、瘙痒、伤口愈合和炎症通路的调节。因此，研究了复杂组织内哪些细胞类型参与这些过程。

OSM和OSMR的诱导在整个皮肤组织中都很明显。富集在表皮组织内以及毛囊内的细胞中尤为显著。毛囊在整个皮肤中可见，并在基线时对OSM染色密集，对OSMR染色较弱。然而，6小时后，OSM和OSMR的诱导变得突出，OSM靠近毛发，OSMR在结构周围显著。注意该区域由降钙素基因相关肽前体阳性的环绕末梢神经支配，负责感知有害毛发拉扯。这表明毛囊结构是OSM诱导和反应的主要枢纽。该结构值得注意的是含有大量干细胞，可能负责部分这种诱导。

制瘤素M通路在人类皮肤中显著存在，正如我们在几个皮肤结构中表达的解剖学证据所证明的那样。然而，制瘤素M也被认为信号传导至DRG感觉神经元，推测是通过刺激表达OSMR的局部长程轴突。

为了正式解决OSM从受损皮肤合成和释放与DRG感觉神经元刺激之间的联系，进行了原位杂交以确定OSM是否可以通过OSMR直接信号传导至伤害性神经元，并确定哪些神经元亚群对这种信号敏感。

使用4-plex组合标记制瘤素M受体以及瞬时受体电位香草素1、速激肽1和mu-阿片受体，鉴定了几种含有OSMR的神经元亚群。TRPV1是一种被有害热刺激致敏的离子通道，有助于疼痛感觉，并可与其他标志物结合使用以鉴定伤害性初级传入神经。由于TRPV1在各类伤害性神经元中广泛表达，还包含了TAC1，其编码P物质，一种当从外周伤害性感受器传递到脊髓背角时参与疼痛信号传导的关键神经肽。还对OPRM1进行了染色，其编码负责mu-阿片镇痛激动剂如吗啡的受体，并且是人类DRG中的重要功能标志物。这种探针组合强烈标记大多数DRG神经元，如先前所述。

我们的染色显示，OSMR在对阿片镇痛有反应的伤害性神经元中表达，以及第二个不表达mu-阿片受体的群体。这种染色组合的另一个特征是OSMR几乎从不与TAC1共表达。少量细胞含有极高水平的TRPV1，与先前的观察一致。这些罕见的神经元是小直径细胞，可能是专用于热感觉的神经元，并且是OSMR阴性/OPRM1阳性，与先前对这种罕见群体的描述一致。

组织损伤后趋化因子诱导定位于汗腺

进行原位杂交染色以了解一部分最强诱导的趋化因子信号基因的解剖学定位，包括CXCL1、CXCL2、CCL2、IL-6、IL-8、OSM和OSMR，在两次4-plex研究中。观察到这些标志物的诱导发生在相互连接的腺体和血管结构中，形成汗腺-血管接口。

我们的染色显示，CXCR4在基础状态下低水平表达，而趋化因子CCL2和CXCL1在切口后在汗腺中强烈诱导。特别是，这些趋化因子的分子激活发生在汗腺的分泌线圈中。类似地，其他趋化因子标志物如OSMR在汗腺的分泌部分被诱导。在较小程度上，IL-6和IL-8也在这个结构中被诱导。有趣的是，汗腺已被认为有助于伤口愈合，并在再上皮化过程中产生表皮突起。虽然这些发现很大程度上尚未探索，但几项研究支持这些结构在损伤反应中的作用。

局部皮肤-皮肤信号通路和损伤皮肤与感觉神经元之间长程相互作用的界定：损伤相互作用组

组织损伤后，DAMPs被激活以响应损伤，启动炎症过程，并开始伤口愈合和皮肤再生。损伤组织分泌的分子参与局部信号传导至皮肤、免疫系统，以及通过感觉神经元进行长程信号传导。这种信号环境可以被视为一个"相互作用组"，其中分泌因子和受体在细胞类型之间相互作用，作为对组织损伤复杂反应的一部分。

通常，我们将相互作用组细分为以下子组件：1）皮肤-皮肤局部相互作用，和2）皮肤到神经的长程相互作用。值得注意的是，这些相互作用还可以按特定细胞类型进一步细分，包括免疫