肥胖相关应激对小鼠血管平滑肌细胞的早期影响具有EGFR和性别依赖性：代谢与体液应激因子的协同作用

《Communications Biology》：Early-phase impact of obesity-associated stress on murine vascular smooth muscle cells depends on EGFR and sex

本研究针对肥胖/2型糖尿病(T2DM)诱导血管功能紊乱的早期机制，探讨了代谢应激(高葡萄糖+游离脂肪酸)与体液应激(血管紧张素II+去甲肾上腺素)对血管平滑肌细胞(VSMC)的协同作用。研究人员发现，在雄性小鼠VSMC中，两种应激因子通过表皮生长因子受体(EGFR)介导产生协同效应，显著促进DNA合成和脂质积累，而EGFR敲除(KO)或雌性VSMC中该协同效应消失。该研究揭示了VSMC-EGFR作为应激信息整合枢纽的关键作用，为早期干预T2DM血管并发症提供了新靶点。

　　

随着全球肥胖和2型糖尿病(T2DM)患病率的持续上升，与之相关的心血管并发症已成为重大公共卫生问题。血管平滑肌细胞(VSMC)作为血管壁的主要构成成分，其功能异常在糖尿病血管病变中扮演着关键角色。VSMC具有显著的可塑性，能够在收缩型与多种去分化表型之间转换，这种表型转换参与血管稳态维持和病理性重塑过程。在T2DM的代谢环境中，高血糖、游离脂肪酸水平升高、肾素-血管紧张素系统过度激活以及交感神经张力增强等多种因素共同构成复杂的应激网络，然而这些因素如何协同作用影响VSMC的早期功能改变，仍是亟待阐明的重要科学问题。

近年来研究表明，表皮生长因子受体(EGFR)在心血管系统中发挥着重要作用，不仅参与细胞分化、迁移和基质稳态的调控，还能通过转激活机制参与心血管功能障碍和重塑过程。特别是在肥胖和T2DM状态下，血管EGFR活性增强，且系统性EGFR激酶抑制剂可改善糖尿病动物的血管功能。前期动物实验显示，特异性敲除VSMC中的EGFR能够显著缓解高脂饮食诱导的血管功能、结构和转录组改变，甚至部分预防肾脏终末器官损伤。但这些体内研究无法区分应激因素对血管细胞的直接作用与系统性间接效应。

为解决这一科学问题，德国马丁·路德大学哈勒-维滕贝格大学Julius-Bernstein生理学研究所的Virginie Dubourg、Sindy Rabe等研究人员在《Communications Biology》上发表了最新研究成果，重点关注肥胖相关应激对血管细胞的早期直接影响。研究团队假设代谢应激因子和体液应激因子在VSMC中存在协同作用，且这种协同效应依赖于EGFR表达。

研究人员分离培养原发性小鼠VSMC（包括野生型WT和条件性EGFR敲除型KO）及内皮细胞(EC)，分别暴露于三种应激条件：代谢应激（20 mmol/L高葡萄糖+100 μmol/L游离脂肪酸）、体液应激（30 nM血管紧张素II+300 nM去甲肾上腺素）以及两者联合应激。通过批量RNA测序(RNA-Seq)结合生物信息学分析，随后进行表型验证实验，系统评估了应激对细胞功能的影响。

研究采用的主要技术方法包括：原发性小鼠血管平滑肌细胞和内皮细胞分离培养技术；批量RNA测序(RNA-Seq)及生物信息学分析（差异表达基因分析、基因本体富集分析、Ingenuity通路分析）；细胞功能评估（BrdU掺入法检测DNA合成、LipidTOX染色分析脂质积累、线粒体呼吸测定仪检测氧消耗率、钙离子诱导的收缩性测定）；蛋白质表达和磷酸化水平检测（免疫荧光、免疫印迹）；统计学分析采用配对样本设计和非参数检验。

基因表达分析

RNA-Seq结果显示，在雄性WT VSMC中，代谢应激和体液应激联合作用时，差异表达基因(DEG)数量远超过两者单独作用之和，表现出明显的协同效应。而在EGFR-KO VSMC中，这种协同效应完全消失，体液应激单独作用也无明显效果。内皮细胞对应激的反应模式与EGFR-KO VSMC相似，表现为仅对代谢应激有反应，且无协同效应。这些结果表明VSMC-EGFR是代谢和体液应激协同作用的关键介质。

细胞周期、增殖

功能实验证实，在WT VSMC中，代谢和体液应激联合作用显著促进BrdU掺入（指示DNA合成），而单独应激作用微弱。EGFR-KO VSMC则无此协同效应。EGFR抑制剂AG1478可阻断联合应激的促增殖作用。EGF与代谢应激在WT VSMC中也表现出协同促增殖效应，进一步证实EGFR的关键作用。

脂质积累

WT VSMC暴露于代谢应激后中性脂质储存增加，而体液应激单独无影响。两者联合作用导致脂质积累显著增强，表现为协同效应。EGFR-KO VSMC仅对代谢应激有反应，无协同作用。亚细胞定位分析显示，脂质在核周区和细胞外周均积累。脂质类型分析表明积累的主要是甘油三酯而非胆固醇。

线粒体功能

代谢应激（而非体液应激）增加WT和KO VSMC的质子漏，降低偶联效率，但两者间无协同效应。线粒体功能改变与EGFR表达无关。

Ca²⁺诱导的收缩性

通过离子霉素诱导胞内Ca²⁺升高，测量细胞圆形度变化评估收缩性。应激处理未显著影响WT或KO VSMC的最大Ca²⁺诱导收缩性，但KO VSMC的基础收缩性低于WT。结果表明在早期应激阶段，VSMC收缩功能尚未发生明显改变。

自发性随机运动性

应激处理不影响WT或KO VSMC的自发运动性，KO VSMC的基础运动性较低。

雌雄VSMC比较

在雌性WT VSMC中，代谢和体液应激无协同作用，表现为与雄性EGFR-KO VSMC相似的反应模式。机制探讨发现，雌性VSMC的EGFR表达水平较低，且应激或EGF刺激后血清反应因子(SRF)Ser103磷酸化增强程度较弱，提示雌性VSMC的EGFR信号转导效能较低。

本研究系统阐明了肥胖/T2DM相关应激因子对血管平滑肌细胞的早期直接影响及其分子机制。主要结论包括：① 代谢应激和体液应激在雄性WT VSMC中通过EGFR依赖的机制产生协同效应，显著影响转录组编程、DNA合成和脂质代谢；② VSMC-EGFR作为应激信息整合枢纽，是协同效应不可或缺的介质；③ 这种协同效应具有性别差异性，雌性VSMC由于EGFR表达较低且下游信号转导较弱，不出现协同反应；④ 在早期应激阶段，VSMC尚未发生明显的表型转换，收缩功能和运动性保持相对稳定。

该研究的创新性在于首次在细胞水平直接证实了肥胖/T2DM多种应激因子的协同作用，并明确了EGFR的核心地位和性别差异特征。研究结果将体内观察到的EGFR重要性延伸到细胞直接作用层面，为理解T2DM血管病变早期事件提供了新视角。尤其重要的是，研究发现体液应激仅在病理代谢环境下才发挥病理生理效应，提示针对EGFR信号通路的干预策略可能对早期预防T2DM血管并发症具有重要价值。未来研究需要进一步阐明协同效应的具体信号转导机制，并验证人类血管细胞中的相关性，以推动转化应用。