基于FRET的纳米尺度膜内钙离子动态监测新方法揭示神经元静息态高钙微域

《Communications Biology》：Evaluation and experimental monitoring of calcium in plasma membrane inner nanoscale cytoplasm regions

本研究针对细胞膜内侧纳米尺度区域（<10 nm）的钙离子（Ca2+）浓度（[Ca2+]m）难以直接测量的技术瓶颈，开发了一种结合膜结合染料与胞质钙探针的FRET（荧光共振能量转移）新方法。研究证实，在静息状态下，神经元膜内侧[Ca2+]m（约400-800 nM）远高于胞质（<100 nM），且NMDA受体（NMDAR）或钠钙交换体（NCX）激活可进一步升高[Ca2+]m。该技术为研究钙信号纳米微域及其在突触可塑性、神经兴奋性毒性等生理病理过程中的作用提供了有力工具。

　　

钙离子（Ca²⁺）是细胞中无处不在的第二信使，在神经系统中更是扮演着从电活动到突触可塑性、基因表达调控等关键角色。然而，钙信号并非均匀分布，而是在细胞膜内侧的纳米尺度微域（nanodomain）中形成局部高浓度，以精确调控特定蛋白（如离子通道、泵、酶等）的功能。例如，N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）与钠钙交换体（NCX）在脂筏（lipid raft）中的紧密偶联，使得局部钙信号能够快速、特异地调控受体活性，而不会引起整个胞质的钙超载。

尽管这一机制在电生理学研究中被广泛推测，但直接测量细胞膜内侧约10纳米范围内的钙离子浓度（[Ca²⁺]_m）一直是一个巨大的技术挑战。传统的基因编码钙指示剂（GECIs）虽然能靶向膜结构，但其表达不稳定，动态范围窄，且高亲和力的探针（如GCaMP6s）在膜内侧高钙环境中极易饱和，无法准确反映动态变化。而常规的共聚焦显微镜受限于衍射极限，无法在空间上区分膜内侧纳米区域与胞质。因此，开发一种能够直接、动态监测膜内侧纳米尺度钙信号的新方法，对于深入理解钙信号转导的分子机制至关重要。

为了回答这一问题，俄罗斯科学院谢切诺夫进化生理学与生物化学研究所的Sergei M. Antonov和Dmitry A. Sibarov团队在《Communications Biology》上发表了一项研究，他们开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的巧妙方法，成功实现了对细胞膜内侧纳米尺度区域钙离子的直接监测，并揭示了该区域在静息状态下即维持着远高于胞质的高钙浓度。

关键技术方法

本研究主要采用了基于荧光共振能量转移（FRET）的钙成像技术。研究人员将细胞膜染色（供体，如DiB或NeuroDiO）与胞质钙离子探针（受体，如Fluo-8或Cal590）相结合。通过选择性激发膜染料，利用FRET效应（作用距离<10 nm）间接激发膜内侧的钙探针，从而特异性监测膜内侧钙信号；同时，直接激发钙探针则可反映胞质整体钙水平。实验在HEK293细胞（部分转染NCX1或GCaMP6s）和原代培养的大鼠皮层神经元（样本来源：Wistar大鼠胚胎）上进行，通过离子霉素（ionomycin）、NMDA或高钾溶液等刺激，观察并量化了膜内侧与胞质钙浓度的动态变化。

研究结果

HEK293细胞中方法的验证

研究人员首先在HEK293细胞中验证了该方法的可行性。他们将细胞膜用蓝色荧光染料DiB染色，胞质内加载钙离子探针Fluo-8。当用双光子（2p）激光（735 nm）选择性激发DiB时，在细胞膜区域观察到了Fluo-8的绿色荧光，这证实了FRET的发生。通过分析线性荧光强度分布，发现FRET诱导的Fluo-8荧光与DiB荧光共定位于细胞膜，其峰宽约为430±55 nm，这反映了显微镜的衍射极限，但荧光信号本身来源于FRET允许的<10 nm区域。相比之下，直接激发Fluo-8则显示其在胞质中均匀分布。当使用离子霉素（ionomycin）增加钙内流时，膜内侧的Fluo-8荧光显著增强，表明该方法能够检测到膜内侧钙浓度的升高。此外，在表达NCX1的HEK293细胞中，通过高钾溶液激活NCX反向转运，也观察到了膜内侧钙浓度的增加，证明了该方法可用于监测生理相关的钙转运过程。

钙敏感荧光蛋白作为次级传感器

为了拓展该方法的适用性，研究人员尝试将膜染料DiB与基因编码的钙指示剂GCaMP6s（靶向细胞膜）配对。实验同样观察到了FRET诱导的GCaMP6s膜定位荧光。然而，与Fluo-8不同，在离子霉素刺激下，膜内侧的GCaMP6s荧光并未增加，而胞质内的GCaMP6s则表现出强烈的荧光增强。这一结果提示，由于GCaMP6s对钙的亲和力较高（K_d约为140 nM），在膜内侧的高钙环境中可能已经处于饱和状态，因此无法检测到钙浓度的进一步升高。这反过来也间接证明了膜内侧的静息钙浓度可能远高于胞质，并提示高亲和力探针不适用于膜内侧钙微域的研究。

神经元中膜下钙的探索

在神经元中，研究人员同样观察到了DiB与Fluo-8的FRET信号，证实了膜内侧高钙微域的存在。通过逐步增加NMDA浓度激活NMDAR，膜内侧的Fluo-8荧光随之增强并最终饱和。根据Fluo-8的K_d（389 nM）和荧光饱和曲线，研究人员估算出在静息状态下，神经元膜内侧的钙浓度（[Ca²⁺]_m）已超过389 nM，而在NMDA刺激下，[Ca²⁺]_m至少达到800 nM。

为了更精确地估算[Ca²⁺]_m，研究人员采用了亲和力更低（K_d= 561 nM）的探针Cal590，并与绿色膜染料NeuroDiO配对。该组合可在可见光下激发，操作更为便捷。实验结果显示，在静息状态下，膜内侧的Cal590荧光强度已超过其半饱和值，据此估算[Ca²⁺]_m约为800 nM，而胞质钙浓度约为100 nM。在NMDA刺激下，[Ca²⁺]_m进一步升高至约1 μM，胞质钙浓度则升至约700 nM。此外，该方法还成功捕捉到了神经元自发的钙振荡，表明染色过程不影响神经元的正常功能，且膜内侧与胞质的钙信号变化是同步的。

研究结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种基于FRET的钙成像新方法，首次实现了对细胞膜内侧纳米尺度区域钙离子浓度的直接、动态监测。研究证实，在静息状态下，神经元膜内侧的钙浓度（约400-800 nM）远高于胞质（<100 nM），这种空间不对称性揭示了钙信号微域的功能隔离，使得局部钙内流能够优先激活附近的效应器（如NCX、CaMKII），而不会引起胞质全局性的钙超载。

该方法克服了现有技术（如GECIs）的诸多局限，包括表达变异性、生理干扰、动态范围窄以及衍射极限等。通过结合膜染料与胞质钙探针，该方法利用<10 nm的FRET距离确保了信号的特异性，同时保留了小分子探针动态范围宽、响应快、生理干扰小的优点。尽管该方法无法提供基因靶向的特异性，但其简便、可靠的特点使其成为研究钙信号纳米微域的有力工具。

该研究为“膜内侧存在高钙微域”这一长期存在的假说提供了直接的实验证据，对于理解钙信号在突触可塑性、神经兴奋性毒性以及药物作用中的精确调控机制具有重要意义。