《Journal of Immunological Methods》：Development of an optimized E0-based indirect ELISA for serological detection of bovine viral diarrhea virus
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牛病毒性腹泻病毒E0蛋白通过异源信号肽优化在HEK293细胞中高效表达，并建立间接ELISA检测方法，灵敏度特异性达96.53%，优于市售试剂盒。
江晨军|盛伟|格桑卓玛|钟亚楠|琼达|黄家燕|周洪波|苏朗子竹
中国西藏林芝市西藏农牧大学动物科学学院。
摘要
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种全球范围内普遍存在的免疫抑制性病原体，持续对养牛业构成挑战，因此需要寻找更有效的诊断和免疫原性靶点。曾经是疫苗和诊断研究核心的包膜糖蛋白E2，由于其显著的序列变异性而不再被认为是最佳选择，这种变异性限制了其跨亚型的效力。相比之下，E0蛋白作为一种更为保守的外膜糖蛋白，由于其免疫原性和跨亚型稳定性而成为有前景的替代品。在本研究中，通过去除BVDV 1b（XZ02）的膜锚定区域并引入异源信号肽（SPs），在HEK293悬浮细胞系统中增强了其分泌效率。在评估的各种信号肽中，组织纤溶酶原激活剂信号肽产生了最高水平的分泌E0蛋白（纯化后可达2.4 mg/mL）。基于这种优化的重组E0抗原，开发了一种间接ELISA方法来检测BVDV特异性抗体。该检测方法表现出高灵敏度、特异性和重复性，与商业IDEXX BVDV Total Antibody试剂盒相比，诊断一致性率为96.53%（κ = 0.9110）。这些结果支持了工程化E0蛋白作为BVDV血清学诊断的可靠且可扩展抗原的潜力。
引言
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种具有包膜的正义单链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）的瘟病毒属（Pestivirus）。BVDV会引起牛的全身性感染，主要影响胃肠道和生殖系统，导致腹泻、黏膜侵蚀和生殖障碍等临床症状（Tao等人，2013；Rivas等人，2022；Chang等人，2021）。妊娠早期的感染可能导致流产或产生持续感染（PI）的后代，这些后代会成为终身病毒库，并在病毒传播中起关键作用。BVDV还能感染其他偶蹄动物，如猪、山羊和绵羊，从而对动物健康和畜牧业生产力构成重大威胁（Fray等人，2000；Hewicker-Trautwein等人，1992；Marshall等人，1996）。该病毒给畜牧业带来了巨大的经济负担，在澳大利亚、新西兰和巴西等国家的血清阳性率超过80%。据估计，每头感染动物的经济损失约为687.8美元，反映了生产力下降、兽医费用增加和繁殖失败带来的累积影响（Nugroho等人，2022）。
由于缺乏特定的抗病毒治疗方法，血清学检测病毒特异性抗体仍然是BVDV监测和控制计划的基石。病毒中和试验（VNT）具有高特异性，但耗时、劳动密集且通量低，不适合大规模常规筛查（Sandvik，2005；Wang和Pang，2024）。因此，酶联免疫吸附测定（ELISAs）已成为首选方法，具有灵敏度高、操作简单、成本效益好和适合高通量检测等优点。大多数用于检测BVDV抗体的间接ELISAs（iELISAs）都针对病毒包膜蛋白E2（Wei等人，2025）。E2蛋白具有很强的免疫原性，但在不同BVDV亚型之间存在高序列变异性，这限制了其在多种菌株中检测抗体的能力（He等人，2025）。相比之下，E0蛋白在不同BVDV基因型中更为保守，也能引发中和抗体，使其成为开发广谱血清学检测方法的理想候选蛋白（Yang等人，2022）。为了保持E0蛋白的天然抗原构象，通常选择真核表达系统而非原核系统，因为真核系统能够进行翻译后修饰，如糖基化，这对蛋白质的正确折叠和免疫反应性至关重要（Zhang等人，2023）。在本研究中，E0蛋白通过真核系统的分泌途径表达。由于天然E0蛋白缺乏信号肽，其分泌效率较低，导致纯化困难且产量减少。为了解决这个问题，引入了多种异源信号序列并进行了系统优化。引入适当的信号肽可以高效分泌目标蛋白，显著提高表达水平，从而提高重组抗原的质量和产量，为后续检测开发做好准备。
基于纯化的E0蛋白，开发了一种间接ELISA（iELISA）来检测BVDV特异性抗体。对该检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行了系统评估，并将其性能与市售IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果表明，所开发的iELISA是一种可靠且有效的工具，适用于BVDV感染的血清学监测和控制。
部分内容摘录
质粒、细胞、病毒和血清
HEK 293细胞和pcDNA3.4表达载体由华中农业大学（武汉）兽医学院的周洪波教授提供。BVDV 1b株（BVDV XZ02）来自西藏农牧大学动物科学技术学院（林芝）。HEK 293细胞使用无血清培养基（Kairui，中国）进行悬浮培养。标准BVDV阳性和阴性牛血清样本
BVDV E0基因的扩增和重组载体的鉴定
使用引物E0-F和E0-R扩增了E0基因片段，生成了495 bp的特异性PCR产物（图1A）。为了验证重组质粒pcDNA3.4-SP-tE0和pcDNA3.4-tE0的成功构建，分别用EcoR V和Bam HI对其进行消化。电泳分析显示，含有信号肽的插入片段约为600 bp，不含信号肽的片段约为500 bp，以及一个共同的载体骨架带约6000 bp（图1B），证实了正确的插入讨论
BVDV的E0糖蛋白（Erns）是一种结构保守的包膜蛋白，具有很强的免疫原性，已被认为是血清学诊断的有希望的抗原（Zhao等人，2015）。与表现出显著抗原变异性的E2蛋白不同，E0蛋白在不同BVDV基因型中高度保守，使其成为开发广谱反应性诊断试剂的理想靶点（Kampa等人，2007；Gao等人，2014）。重要的是，E0
结论
在本研究中，BVDV E0糖蛋白在含有优化信号肽的HEK293悬浮细胞系统中得到了高效表达。在评估的各种信号序列中，TPA信号肽表达了最高的水平，重组蛋白产量达到2.4 mg/mL，确保了高纯度并适合用于诊断应用。基于这种高质量的抗原，开发了一种iELISA方法来检测BVDV特异性抗体。
CRediT作者贡献声明
江晨军：撰写——原始草案、验证、方法学、数据整理。盛伟：方法学。格桑卓玛：资源获取。钟亚楠：方法学。琼达：方法学。黄家燕：方法学。周洪波：方法学。苏朗子竹：资金筹集。
资助
本工作得到了西藏自治区科学技术计划的支持，项目名称为“牦牛和藏猪重大病毒性腹泻疾病的预防和控制技术研究”（XZ202401ZY0025）和中国肉牛和牦牛产业技术体系项目（CARS-37）。
