《The Journal of Molecular Diagnostics》：Dideoxy sequencing enhances detection of KIT mutations in GISTs initially evaluated by NGS hotspot panels
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GIST分子检测中短读测序NGS漏检较大插入/缺失突变风险，建议联合dideoxy测序。
丽莎·罗宾逊（Lisa Robinson）| 莎琳·拉普（Sharleen Rapp）| 张伟伟（Weiwei Zhang）| 杰奎琳·波普（Jaclyn Pope）| 艾莉森·M·库什曼-沃库恩（Allison M. Cushman-Vokoun）
内布拉斯加大学医学中心病理学、微生物学和免疫学系，983135 内布拉斯加大学医学中心，奥马哈，NE 68198-3135
摘要
胃肠道间质瘤（GISTs）的主要特征是KIT或PDGFRA基因的突变。突变检测对于制定最佳治疗方案至关重要。下一代测序（NGS）技术在这些肿瘤的检测中非常有用，因为它可以同时评估多个基因。然而，使用NGS技术对经过福尔马林固定的样本进行短读长测序时，存在漏检较大规模插入/缺失变异的风险。在九年的时间里，我们对55名患者的样本进行了GIST检测，方法包括基于扩增子的半导体NGS测序（使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2，简称CHPv2），或基于CHPv2的GIST检测面板，以及Oncomine Precision Assay。对于阴性病例，我们按照临床方案进行了KIT和PDGFRA基因突变的双脱氧测序。在完成的所有55例分析中，有47例（85%）通过NGS检测出KIT或PDGFRA突变；另有3例是由于其他基因的致病性变异导致的阳性结果。在通过双脱氧测序分析的5例病例中，所有5例（占所有样本的9%）均检测出致病性或可能致病的KIT突变。其中12%的KIT突变需要通过双脱氧测序才能明确。我们的研究结果表明，基于扩增子的短读长NGS检测方法可能会遗漏大量具有临床意义的KIT突变，因此对于NGS检测结果为阴性的病例，应考虑采用其他检测方法进行进一步验证。
引言
胃肠道间质瘤（GISTs）是一种起源于Cajal间质细胞的软组织肿瘤
1, 2。这类肿瘤最常见于胃或小肠，但也可能出现在胃肠道的其他部位。GISTs主要是梭形细胞肿瘤，但在胃部区域也可见上皮样形态。通过免疫组化染色，它们通常对CD34、CD117（KIT抗原）和DOG1（最具特异性和敏感性的标记物）呈阳性
3。GISTs可能是惰性的，切除后可以治愈；也可能表现出侵袭性，导致局部病变或转移，最常见的转移部位是肝脏。判断GIST行为的重要因素包括位置（胃部比小肠更易发生肿瘤）、大小（小于10厘米）和有丝分裂率（每50个高倍视野下少于5次有丝分裂），但这些肿瘤的分子病理学特征也与其行为密切相关
4。
大约75-80%的GISTs存在
KIT基因突变，该基因编码一种III型受体酪氨酸激酶（RTK）。最常见的突变发生在第11外显子，该外显子编码膜近端结构域。这些致病性变异通常为插入/缺失或错义突变。其他突变也可能发生在第9、13和17外显子，外显子的突变类型与肿瘤的解剖位置、治疗反应和预后相关。第11外显子的串联重复突变多见于胃部肿瘤，预后较好；而第9和17外显子的突变则更多见于小肠肿瘤，且通常具有更侵袭性的生物学特性。大多数第11外显子突变的GISTs对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）如伊马替尼反应良好，而第9外显子突变的GISTs则需要更高剂量的药物
5PDGFRA（编码血小板衍生生长因子受体-α，另一种III型RTK）突变见于10-15%的GISTs，主要发生在与
KIT相同的外显子（12、14和18）中，这类GISTs通常对伊马替尼敏感。然而，携带第18外显子p.D842V突变的GISTs对伊马替尼不敏感
5。2020年，针对这种突变的新型药物avapritinib获得了批准
6。其他潜在的分子改变包括编码琥珀酸脱氢酶复合体成员的基因（
SDHA、SDHB、SDHC、SDHD）中的致病变异，这些突变会导致SDHB的缺失，可通过免疫组化检测出来
7, 8。在少数GISTs中，还可能观察到BRAF p.V600E（1-3%的GISTs）、
NTRK融合或其他MAPK通路的改变
9, 10, 11, 12, 13, 14。大约5-10%的神经纤维瘤病患者也会出现GISTs，但这些病例中
KIT或
PDGFRA突变较少见
15, 16, 17。携带
NF1突变的GISTs多见于小肠，且可能对TKIs不敏感。因此，准确识别致病性变异对于制定针对性治疗方案（如果临床适用）以及潜在的遗传疾病诊断非常重要。
传统上，在临床实践中，KIT和PDGFRA突变是通过检测相关外显子的双脱氧测序来发现的。随着下一代测序（NGS）技术的应用，现在大多数GISTs都是通过包含相关基因的小型或大型检测面板进行检测的。NGS检测面板可以使用混合捕获或基于扩增子的PCR技术构建文库，并通过合成测序或半导体测序进行数据分析，每种技术各有优缺点。本研究表明，虽然基于扩增子的短读长半导体NGS测序在检测大多数GIST突变方面非常有效，但对于NGS检测结果为阴性的病例，仍应考虑使用双脱氧测序作为补充方法。
研究方法
伦理批准
本研究已获得内布拉斯加大学医学中心监管事务办公室（ORA）的批准，并符合HHS法规（45 CFR 46）的要求，确保了研究对象的权利和福利得到充分保护（IRB编号0571-25-EP）。
研究对象
本研究分析了2015至2024年间内布拉斯加大学医学中心的分子病理学数据库，以识别那些通过半导体测序技术确诊的GIST或疑似GIST病例
双脱氧测序
在标准PCR处理（95°C变性1次循环，随后进行45个循环：95°C 30秒、68°C 30秒、72°C 30秒，最后72°C 4分钟）后，使用BigDye Terminator v.3.1循环测序试剂盒和ABI 3500xl片段分析仪（Thermo Fisher Scientific）进行了双脱氧测序。如果NGS未检测到KIT、PDGFRA或BRAF突变（或其他致病性突变未知），则根据内部规定进行双脱氧测序
结果
从位置来看，31例（56%）GISTs位于胃部，16例（29%）来自小肠，1例（2%）位于肛门周围，7例（13%）为腹部肿块或转移性病变。其中2例样本使用了50 GCP（PGM）平台进行分析，38例样本使用了生物信息学处理的GIST检测面板（在PGM或S5测序仪上进行），15例样本使用了OPA检测方法（Genexus仪器）。在双脱氧测序之前，55例样本中有36例（65%）被检测出KIT突变
讨论
基于扩增子的文库制备结合半导体测序方法在分子诊断实验室中广泛应用，因为它能够快速处理少量福尔马林固定（FFPE）组织样本。市面上有适用于自动化文库制备、克隆扩增和高通量测序的商业试剂盒，这些试剂盒可用于针对多种肿瘤类型制定靶向治疗策略。在检测过程中产生的扩增子...
