骨髓源性CD169+巨噬细胞通过分泌CCL12招募CCR2+单核细胞加剧自身免疫性肝炎

《Experimental & Molecular Medicine》：Bone marrow-derived CD169+ macrophages promote autoimmune hepatitis by recruiting CCR2+ monocytes via secreting CCL12

本研究针对自身免疫性肝炎（AIH）中巨噬细胞亚群功能不清的问题，揭示了骨髓源性CD169+巨噬细胞通过IFNγ响应性分泌CCL12招募CCR2+单核细胞的新机制。研究人员通过构建CD169-DTR基因敲除小鼠模型，结合单细胞测序和流式分选技术，发现靶向清除CD169+巨噬细胞或中和CCL12均可显著改善ConA诱导的急性肝损伤，为AIH治疗提供了新的潜在靶点。

　　

在肝脏这个人体最大的实质性器官中，免疫系统的平衡维护至关重要。自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis, AIH）作为一种病因不明的炎症性肝病，其特征是免疫介导的肝细胞破坏，导致肝脏进行性坏死性炎症。患者临床表现为急性肝炎，可能进展为肝硬化和终末期肝衰竭。刀豆蛋白A（Concanavalin A, ConA）诱导的急性肝损伤动物模型被广泛用于模拟人类临床急性肝炎和免疫介导的肝损伤。研究表明，肝脏中的巨噬细胞在ConA诱导的AIH中扮演重要角色。巨噬细胞是肝脏中最丰富的免疫细胞，参与维持肝脏免疫稳态。然而，肝脏中的巨噬细胞具有显著的异质性。库弗细胞（Kupffer cells, KCs）是健康肝脏中的主要巨噬细胞群，它们起源于卵黄囊，在稳态条件下依靠自我更新补充，不依赖于骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）。当肝炎发生时，KCs被激活，随后炎症性Ly6C^hi单核细胞源性巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MoMFs）被招募到肝脏参与炎症反应。尽管每个巨噬细胞亚群在维持肝脏稳态中扮演不同角色，但不同亚群在调节肝脏免疫中的具体细胞和分子机制仍不清楚。

CD169（又称唾液酸粘附素或Siglec1）是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（siglec）家族的原型成员。它最初被报道为从骨髓、淋巴结、肝脏和脾脏分离的巨噬细胞亚群的标志物。近年来，CD169⁺巨噬细胞被认为是不能简单定义为M1或M2巨噬细胞的独特巨噬细胞群。目前，CD169⁺巨噬细胞已被证明在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用。有报道称，CD169⁺巨噬细胞在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎中增加。此外，外周血CD169⁺单核细胞的相对数量与类风湿关节炎的疾病活动度显著正相关，甚至可能作为生物标志物。同样，系统性红斑狼疮患者和1型糖尿病儿童的CD14⁺CD169⁺单核细胞也显著增加。此外，原发性胆汁性胆管炎（Primary Biliary Cholangitis, PBC）患者外周血单核细胞上CD169高表达。AIH和PBC都被归类为自身免疫性肝病。然而，CD169⁺巨噬细胞与AIH之间的关系仍不清楚。

为了阐明CD169⁺巨噬细胞在AIH中的作用，研究人员开展了一项系统性的研究。本研究主要运用了以下关键技术方法：利用CD169-白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor, DTR）转基因小鼠模型特异性清除CD169⁺细胞；对来自健康对照和AIH等肝病患者的肝活检组织进行免疫组化分析；通过流式细胞术和细胞分选技术鉴定肝脏免疫细胞亚群；采用骨髓移植实验区分不同来源的巨噬细胞功能；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析基因表达特征；以及体外细胞培养和刺激实验验证分子机制。

CD169⁺巨噬细胞在AIH患者肝脏中显著增加且与疾病严重程度正相关

研究人员首先通过分析人肝单细胞RNA测序数据集确认了人肝中CD169⁺细胞为巨噬细胞。他们对健康对照（n=6）和AIH（n=40）、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB）（n=7）、PBC（n=21）及代谢功能障碍相关脂肪肝病（Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD）（n=12）患者的肝组织进行免疫组化染色，结果显示AIH患者肝脏中CD169⁺巨噬细胞数量显著高于健康对照和其他肝病患者。更重要的是，CD169⁺巨噬细胞的数量随着炎症分级的进展而增加，并与肝脏炎症分级呈极强正相关。CD169与巨噬细胞标志物CD68共染色证实了这些细胞的巨噬细胞属性。

AIH小鼠肝脏中增加的CD169⁺细胞主要是CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺浸润性巨噬细胞

在野生型小鼠中建立时间梯度的AIH模型后，随着肝脏炎症加剧和坏死区域扩大，肝脏中CD169⁺巨噬细胞的数量也逐渐增加。流式细胞术分析表明，ConA给药12小时后，Ly6C⁺单核细胞和Ly6C⁺巨噬细胞群中CD169⁺细胞比例增加，而组织驻留的TIM4⁺CD169⁺库弗细胞比例显著下降。免疫荧光结果进一步证实，AIH肝脏中增加的CD169⁺细胞是单核细胞源性巨噬细胞而非库弗细胞。

CD169⁺巨噬细胞是ConA诱导肝坏死所必需的

为了阐明CD169⁺巨噬细胞在AIH中的作用，研究人员向CD169-DTR小鼠注射白喉毒素以清除CD169⁺巨噬细胞。与野生型小鼠相比，清除CD169⁺巨噬细胞后，小鼠在致死剂量ConA攻击下的存活率提高，血清ALT和AST水平显著降低，促炎细胞因子IFNγ和TNFα水平下降，肝组织损伤和坏死明显改善，肝脏炎症相关基因表达下降。

骨髓源性CD169⁺巨噬细胞是AIH进展中的关键亚群

通过骨髓移植实验，研究人员发现当将野生型骨髓细胞移植到CD169-DTR小鼠并应用白喉毒素后，骨髓源性的野生型CD169⁺细胞保留，而肝脏驻留的CD169⁺库弗细胞被清除。这些嵌合体小鼠在ConA给药后表现出与野生型小鼠相似的表型，肝损伤比移植了CD169-DTR骨髓的CD169-DTR小鼠更严重，表明骨髓源性CD169⁺巨噬细胞是ConA诱导肝损伤中的重要亚群。

CD169⁺巨噬细胞清除改变了AIH中的免疫微环境

流式细胞术和免疫组化分析显示，清除CD169⁺巨噬细胞后，AIH肝脏中NK细胞、T细胞、中性粒细胞和Ly6C⁺单核细胞的浸润减少。特别是，CD169⁺巨噬细胞清除抑制了CD4⁺T细胞向Th1方向分化，促进了调节性T细胞（Treg）分化，并降低了表达IFNγ的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞比例，改善了AIH肝脏的炎症状态。

CD169⁺巨噬细胞对IFNγ有响应

单细胞RNA测序分析显示，编码CD169的siglec1基因主要在巨噬细胞群中表达，且ConA组中siglec1表达细胞数量高于对照组。与CD169^-巨噬细胞相比，CD169⁺巨噬细胞高表达IFNγ响应基因。中和IFNγ后，肝脏坏死减轻，CD169⁺巨噬细胞数量减少。体外实验证实，IFNγ刺激可诱导骨髓源性巨噬细胞和人外周血单核细胞中CD169表达上调。

CD169⁺巨噬细胞在AIH中选择性表达CCL12

KEGG和GO富集分析表明，CD169⁺巨噬细胞中趋化因子信号通路、单核细胞迁移和淋巴细胞迁移通路富集。其中Ccl12、Ccl2、Cxcl10和Ccl6等趋化因子基因表达上调。通过流式分选肝脏中的CD169⁺巨噬细胞，发现Ccl12在CD169⁺巨噬细胞中的表达能力显著增强，且其表达水平和蛋白分泌量均远高于其他趋化因子。IFNγ刺激可进一步促进骨髓源性巨噬细胞中Ccl12的表达和CCL12的分泌。

CCL12招募单核细胞和巨噬细胞加剧AIH

单细胞RNA测序和流式细胞术分析表明，CCL12的唯一受体CCR2主要在巨噬细胞上表达。体外实验显示，CCL12以浓度依赖性方式趋化RAW264.7巨噬细胞。中和CCL12可显著改善ConA诱导的小鼠肝坏死，降低血清ALT和AST水平，减少单核细胞和巨噬细胞的肝脏浸润。

讨论与结论

本研究首次系统地揭示了CD169⁺巨噬细胞在自身免疫性肝炎中的关键作用。研究发现AIH肝脏中至少存在两种不同的CD169⁺巨噬细胞群体：骨髓源性的Ly6C^hi浸润性巨噬细胞和组织驻留的CD169⁺巨噬细胞，其中骨髓源性CD169⁺巨噬细胞是驱动AIH进展的关键亚群。与AIH中的CD169^-巨噬细胞相比，CD169⁺巨噬细胞对IFNγ更敏感，并能主动分泌CCL12，从而招募CCR2⁺单核细胞和巨噬细胞，充当"巨噬细胞放大器"的角色。

CD169⁺巨噬细胞清除不仅减少了单核细胞和巨噬细胞的肝脏浸润，还降低了T细胞浸润，这可能与CD169⁺巨噬细胞高表达招募T细胞的趋化因子CXCL10有关。同时，CD169⁺巨噬细胞清除诱导了免疫抑制性Treg细胞的显著扩增，有助于减轻AIH特有的自身免疫反应失调。

值得注意的是，CD169⁺巨噬细胞的趋化因子分泌谱可能因疾病而异。与本研究结果不同，先前研究表明CD169⁺巨噬细胞通过分泌CCL8而非CCL12促进结肠炎。这表明CD169⁺巨噬细胞在不同疾病和组织中可能表现出不同的反应，反映了它们在特定微环境中的适应性。

本研究也存在一些局限性，如未深入探讨CD169⁺库弗细胞在AIH中的作用，未使用CD169特异性敲除小鼠研究CD169分子本身的功能，以及主要关注AIH的急性炎症阶段而非慢性进展过程。此外，CD169⁺巨噬细胞在损伤后的修复反应中的作用也未在本研究中涉及。

综上所述，这项发表于《Experimental & Molecular Medicine》的研究阐明了骨髓源性CD169⁺巨噬细胞通过IFNγ-CCL12-CCR2轴加剧自身免疫性肝炎的新机制，为开发针对这一特定巨噬细胞亚群的AIH治疗策略提供了重要的理论依据和潜在靶点。未来，靶向骨髓源性CD169⁺巨噬细胞可能成为AIH治疗的潜在新策略。