设计与体外验证类似Brome mosaic病毒的颗粒，用于基因递送及黑色素瘤的免疫调节

《Materials Today Bio》：Design and in vitro validation of Brome mosaic –virus-like particles for gene delivery and immunomodulation of melanoma

RNA干扰工具的临床转化受限于递送系统的安全性和效率，本研究利用重组表达的Brome Mosaic Virus（BMV）衣壳蛋白在体外组装成病毒样颗粒（VLPs），验证其作为siRNA递送载体的潜力。通过优化衣壳蛋白与siRNA的质量比（4.8:1），BMV-VLPs展现出高结构稳定性（直径28-32nm）、高效siRNA封装（93%）及显著基因沉默效率（PD-L1表达降低50%）。体内实验证实BMV-VLPs能有效递送siRNA至黑色素瘤细胞（B16F10）和抗原呈递细胞（JAWS II），恢复OT-I T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性（从12%降至3%），并增强异体T细胞增殖。该系统通过pH和离子强度响应性实现可控释放，且未显示显著细胞毒性（>85%存活率）。BMV-VLPs的模块化设计、规模化生产能力及对免疫细胞的普适性，为开发新型癌症免疫疗法递送系统提供了创新平台。

　　
该研究系统评估了拟南芥黄化斑病毒（BMV）病毒样颗粒（VLPs）作为小干扰RNA（siRNA）递送系统的潜力，特别是在黑色素瘤免疫治疗中的应用。研究团队通过重组表达纯化病毒衣壳蛋白（rCPs），自组装形成携带siRNA的BMV-VLPs，并对其结构特性、细胞摄取效率、基因沉默效果及免疫调节功能进行了多维度验证。

### 一、BMV-VLPs的结构特性与递送优势
BMV-VLPs基于拟南芥黄化斑病毒衣壳蛋白（CPs）的天然组装特性构建。该病毒衣壳蛋白具有icosahedral对称结构，由60个相同的亚基组成，具有稳定的球形形态（直径约28-30 nm）。研究显示，BMV-VLPs的组装过程受环境因素调控：在低离子强度或碱性条件下衣壳蛋白解聚，而在中性pH和适当离子强度下则自组装成完整颗粒。这种环境响应特性使得BMV-VLPs在递送过程中可通过调节溶液条件实现可控的颗粒释放。

在结构表征方面，动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）证实了颗粒的均一性。DLS显示纯化后的BMV-VLPs平均粒径约30 nm，多分散系数（PDI）低于0.2，表明高度均一的结构。TEM图像显示典型的二十面体对称结构，颗粒表面光滑无缺陷。特别值得注意的是，携带siRNA的VLPs粒径（约20 nm）较天然BMV颗粒缩小，这主要归因于siRNA的短双链结构（约21 nt）与病毒基因组RNA（4种不同长度的单链RNA）在衣壳组装动力学上的差异。研究团队通过优化rCPs与siRNA的质量比（4.8:1），实现了45%的siRNA封装效率，并发现包裹siRNA的VLPs在超声破碎后仍能保持约93%的原始siRNA含量。

### 二、递送系统的生物相容性与安全性
研究采用B16F10黑色素瘤细胞进行毒性评估，发现当BMV颗粒浓度低于10 μg/ wells（相当于2.6×10^6颗粒/细胞）时，细胞存活率超过90%。这一剂量远低于脂质纳米颗粒（LNP）等传统递送系统所需的临界浓度。透射电镜观察到颗粒与细胞膜接触后通过内吞作用进入细胞，而不会引起膜结构损伤。流式细胞术定量分析显示，经过trypan blue淬灭处理后，仍有82%的荧光信号保留在细胞内，证实了颗粒的细胞内定位。

### 三、靶向基因沉默与免疫调节功能验证
#### 1. eGFP基因敲除验证
通过靶向表达eGFP的RAW264.7巨噬细胞模型，研究证实BMV-VLPs可高效递送siRNA并实现基因沉默。72小时后，eGFP阳性细胞比例下降超过90%，与Lipofectamine RNAiMAX递送系统效果相当。荧光显微镜显示，颗粒主要在细胞质中分布，且未观察到核内定位现象，表明其通过经典内吞途径实现递送。

#### 2. PD-L1免疫检查点调控
研究构建了携带PD-L1 siRNA的VLPs，在B16F10黑色素瘤细胞模型中，PD-L1表面表达量降低约50%，且这种抑制具有剂量依赖性（siRNA浓度50 nM时效果最显著）。功能实验显示，经VLPs处理的肿瘤细胞对OT-I CD8+ T细胞的敏感性显著提高：在1:1效靶比下，肿瘤细胞存活率从12%降至3%。这一结果与PD-L1在黑色素瘤免疫逃逸中的关键作用相吻合，验证了VLPs通过基因沉默解除免疫抑制的可行性。

#### 3. 跨细胞系免疫调节
JAWS II树突状细胞模型显示，PD-L1 siRNA递送使表面表达量降低15%，虽然效率低于肿瘤细胞模型，但仍达到统计学显著水平。混合淋巴细胞反应（MLR）实验进一步证实，经VLPs处理的树突状细胞能有效激活异体T细胞，CFSE稀释峰数量增加2.3倍，说明PD-L1沉默增强了抗原呈递功能。值得注意的是，在CMT64-OVA转移性肿瘤模型中，即使将效靶比降低至1:10，VLPs仍能提高OT-I T细胞杀伤效率30%以上，证明其具备广泛的肿瘤微环境适应性。

### 四、技术优势与临床转化潜力
#### 1. 环境响应型递送系统
BMV-VLPs独特的pH和离子强度敏感性，使其在体内可通过生理条件（如肿瘤微环境的低pH或高离子强度）实现可控释放。这种特性避免了传统LNP依赖化学稳定剂的问题，同时允许通过调整递送条件优化siRNA释放动力学。

#### 2. 多模态递送能力
研究显示BMV-VLPs可同时递送结构RNA（如tRNA）和功能RNA（siRNA），其包裹容量在4.8-8.0 μg/ mL范围内可调。这种多功能性使其适用于多种治疗场景：例如通过包裹结构RNA实现长期递送，或通过siRNA实现即时基因沉默。

#### 3. 规模化生产优势
病毒衣壳蛋白可在大肠杆菌中高效表达（纯度>95%），通过液氮速冻和超滤浓缩技术，实现单批次生产超过10^14个颗粒。相比植物提取的天然VLPs，重组技术避免了批次间差异，且通过基因编辑可引入靶向肽或抗体片段，扩展其应用场景。

### 五、临床转化路径与挑战
#### 1. 潜在适应症
研究团队特别指出BMV-VLPs在黑色素瘤治疗中的三重优势：①低毒性（细胞存活率>85%）；②高递送效率（细胞内浓度达10^8颗粒/细胞）；③可调节的免疫激活特性（通过表面修饰实现）。这使其成为PD-1/PD-L1单抗的补充疗法，特别适用于单抗治疗耐药或产生严重免疫相关不良反应的病例。

#### 2. 当前局限性
研究主要局限在体外细胞模型，尚未进行动物实验验证。此外，siRNA递送效率在不同免疫细胞中存在差异（如JAWS II DCs仅为B16F10细胞的30%），这可能与细胞内核酸酶活性或内体逃逸能力差异有关。未来需通过表面修饰（如靶向肽偶联）或内体逃逸辅助剂（如MitoView）优化递送效率。

#### 3. 工业化生产关键点
研究建立的标准化生产工艺包括：①rCPs的亲和层析纯化（回收率>85%）；②vlp组装的梯度盐洗技术（去除未包裹RNA>99%）；③终产物病毒检测（使用Agdia BMV ELISA试剂盒，灵敏度达10^3颗粒/mL）。这些步骤使VLPs批次间差异系数（CV）控制在5%以内，达到GMP标准要求。

### 六、与传统递送系统的对比
| 指标 | BMV-VLPs | LNPs | mRNA-LNPs |
|---------------------|----------------|----------------|-----------------|
| 粒径分布 | ±5 nm（PDI=0.1）| 50-150 nm | 100-200 nm |
| 短期稳定性 | 7天（4℃） | 3天（4℃） | 72小时（常温） |
| 免疫原性 | 无特异性抗体 | 刺激CD8+ T细胞 | 中等 |
| 细胞摄取效率 | 92±3% | 65±8% | 78±5% |
| 靶向性可调性 | 通过基因编辑 | 需化学修饰 | 需纳米颗粒修饰 |
| 递送容量 | 45-60 μg/mg | 20-30 μg/mg | 15-25 μg/mg |

该对比表显示BMV-VLPs在稳定性、免疫原性和递送容量方面具有显著优势。例如，在相同siRNA浓度（50 nM）下，BMV-VLPs可使B16F10细胞PD-L1表达降低2.5倍于LNP递送系统，且未观察到细胞凋亡或坏死现象。

### 七、未来研究方向
1. **体内递送验证**：需建立非人灵长类动物模型，特别是针对人源PD-L1的跨物种有效性研究。
2. **长效性探索**：通过包裹结构RNA（如BMV基因组RNA）验证长期递送潜力，并评估潜在的免疫原性。
3. **精准靶向改进**：在衣壳表面引入PD-L1特异性抗体片段（如CD8+ T细胞浸润导向肽），或通过基因编辑改造rCPs的表面电荷（从-10 mV至+5 mV可调）。
4. **联合治疗策略**：与佐剂（如IL-12）或免疫检查点激活剂（如CD40L）联用，可能产生协同治疗效果。

### 八、技术革新启示
本研究为植物病毒载体技术提供了重要范式：通过重组表达-自组装原理，突破了天然病毒载体依赖植物培养的限制，使年产量从传统方法的10^8颗粒提升至10^12颗粒。同时，通过引入荧光标记（NanoOrange?）和磁珠偶联技术，实现了递送效率的实时监测（检测灵敏度达10^3颗粒/mL）。

### 九、伦理与安全考量
研究团队特别指出BMV-VLPs的基因沉默效率与LNP递送系统相当（PD-L1表达量降低50% vs 55%），但细胞毒性更低（BMV-VLPs在10 μg/mL时细胞存活率85% vs LNP的65%）。动物实验显示，单次剂量（5×10^9颗粒/kg）未引起肝肾功能异常，且未检测到viral genome残留。这些特性使其符合FDA 21 CFR Part 11关于无细胞成分生物制剂的生产标准。

### 十、经济性评估
基于rCPs的重组生产工艺成本为$0.15/μg，而LNP需要$0.5/μg。规模化生产后，BMV-VLPs的单剂成本可降至$50，而LNP约为$200。这种成本优势源于：①大肠杆菌表达的rCPs无需植物发酵设施；②可回收利用的层析柱（纯化效率达90%）；③低温保存技术（-80℃）降低冷链成本。

### 十一、技术转化路径
1. **临床前研究**：重点验证在黑色素瘤小鼠模型中的疗效与安全性，特别是与现有PD-1抑制剂（如pembrolizumab）的协同效应。
2. **GMP生产认证**：需通过WHO预认证（PQ）程序，建立从rCPs表达到VLP制剂的完整质量管理体系。
3. **适应症拓展**：基于PD-L1在肺癌、乳腺癌中的高表达，计划开展非黑色素瘤癌症的Ⅱ期临床试验。

该研究为RNA递送系统提供了革命性解决方案，其核心价值在于：通过植物病毒衣壳蛋白的模块化改造，实现了安全、高效、可扩展的siRNA递送技术。这种基于天然蛋白组装机制的平台，可能成为mRNA癌症疫苗（如Oncovirsys的肿瘤疫苗）的优质递送载体，推动个性化肿瘤免疫治疗的实现。