帕金森病大脑神经元中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的动态失衡及其表观遗传调控机制研究

《npj Parkinson's Disease》：Parkinson’s disease-associated alterations in DNA methylation and hydroxymethylation in human brain

本研究针对帕金森病(PD)表观遗传研究中难以区分5-甲基胞嘧啶(5mC)与5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的难题，通过对人脑顶叶皮层富集神经元进行氧化重亚硫酸盐(oxBS)与重亚硫酸盐(BS)联合EPIC芯片分析，并应用混合效应模型同时建模5mC与5hmC数据，首次系统揭示了PD相关的108个相互作用差异修饰胞嘧啶(iDMC)，涉及LRRK2通路、内溶酶体分选及神经炎症等关键基因的甲基化/羟甲基化失衡，为理解PD中基因-环境互作提供了新机制。

　　

在探索神经退行性疾病奥秘的征程中，帕金森病(Parkinson's Disease, PD)始终是科学家们攻坚的重点。绝大多数PD病例是散发性的，其发病被认为是衰老、遗传因素和环境暴露之间复杂相互作用的结果。在这种相互作用中，表观遗传学机制犹如一位关键的“翻译官”，动态响应年龄增长和环境变化，并调控基因表达，因此被认为是连接遗传易感性与环境风险因素的重要桥梁。在众多表观遗传标记中，DNA甲基化(5-methylcytosine, 5mC)及其氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)尤为引人关注。5hmC在大脑中含量丰富，对环境暴露敏感，且在基因调控中扮演着不同于5mC的特殊角色。然而，长期以来，由于技术限制，大多数基于重亚硫酸盐(Bisulfite, BS)转化的研究无法区分5mC和5hmC，将两者混合检测，这无疑模糊了各自独特的生物学功能。尽管近期有研究开始关注5hmC在PD中的作用，但往往将5mC和5hmC分开分析，忽略了它们之间的生物学相互依赖关系。这种分析策略可能遗漏掉一些关键信息：即在总甲基化水平(BS-β值)不变的情况下，5mC和5hmC之间的比例可能发生了动态的、具有生物学意义的“转换”。为了更精确地描绘PD大脑中的DNA修饰图谱，揭示此前被标准方法所忽略的表观遗传变化，一项发表在《npj Parkinson's Disease》上的研究应运而生。

本研究的关键技术方法主要包括：从 Banner Sun Health Research Institute 脑库获取的人死后顶叶皮层组织样本；通过磁激活细胞分选技术(MACS)富集神经元核；使用氧化重亚硫酸盐转化结合Illumina EPIC甲基化芯片分别获取5mC和5hmC信号；利用最大似然估计法计算真实的β_mC和β_hmC值；并应用混合效应模型识别相互作用差异修饰胞嘧啶(iDMC)，以检测5mC与5hmC比例在PD与对照间的显著差异。

Identification of iDMCs

研究人员从人类死后顶叶皮层中富集神经元核，并对男性受试者样本进行了全表观基因组关联分析。他们采用了一种创新的混合效应模型，将配对的重亚硫酸盐和氧化重亚硫酸盐数据作为重复测量值进行同步建模，以识别5mC和5hmC比例发生显著变化的位点，即相互作用差异修饰胞嘧啶。分析结果显示，在帕金森病患者中，共鉴定出108个iDMC，其错误发现率低于0.05。这些位点显示出5mC和5hmC比例的显著偏移。值得注意的是，其中76个iDMC表现出5mC相对增加而5hmC相对减少（负β系数），32个则相反（正β系数）。基因组注释分析表明，这些iDMC主要富集在基因体内以及转录抑制的染色质区域，如多梳蛋白抑制区。

Annotation of iDMCs

对108个iDMC进行基因注释发现，其中71个位于基因内部，关联到83个基因。此外，利用GREAT工具对含有iDMC的增强子区域进行靶基因预测，又识别出67个潜在靶基因。综合来看，本研究共确定了134个独特的基因可能与PD的表观遗传调控相关。

Overlap with previous EWAS studies

为了评估新方法的独特性，研究者将本次结果与他们之前仅使用BS转化的研究以及其他已发表的PD大脑EWAS研究进行了比较。结果显示，当前研究鉴定出的83个iDMC相关基因中，仅有7个（AGAP1, CACNA1H, COX19, LMF1, PMFBP1, RAB32, TFAP2A）在之前的BS-only分析中也存在差异甲基化，尽管发生在不同的胞嘧啶位点上。这表明，同时分析5mC和5hmC的动态转换能够发现大量被传统BS方法所遗漏的PD相关表观遗传改变。在与另外四项近期PD大脑EWAS研究的交叉对比中，AGAP1、CACNA1H和RAB32等基因在多个研究中被重复发现，提示这些基因的表观遗传调控在PD中可能具有普遍重要性。

Gene ontology enrichment analysis and protein-protein interaction networks

为了深入理解这134个基因的功能，研究者进行了基因本体富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络构建。GO生物过程富集分析显示，这些基因显著富集在16个GO条目中，归为8个功能组，包括多种细胞发育通路和趋化因子介导的信号通路等。细胞组分分析则发现这些基因与连环蛋白复合物、剪接体和质膜锚定组分等相关。PPI网络分析进一步揭示了这些基因产物之间存在的潜在功能联系。

Endolysisosomal genes

在多个PD EWAS研究中重复出现的基因中，有两个编码内溶酶体相关蛋白的基因尤为突出：RAB32和AGAP1。本研究在RAB32的启动子区发现了一个iDMC，显示5mC相对增加而5hmC相对减少。RAB32是一种小GTP酶，可与LRRK2、PINK1、VPS35等其他PD相关基因编码的蛋白相互作用，而这些基因是内溶酶体分选通路的关键介质，该通路已知与PD发病机制密切相关。最近的研究更是将RAB32确定为常染色体显性PD的致病基因。另一方面，在AGAP1的一个可变外显子中发现的iDMC则显示出5hmC相对增加和5mC相对减少。AGAP1是一种ArfGTP酶激活蛋白，是适配体蛋白复合物3运输蛋白的直接调节因子，并参与细胞骨架重塑。有观点认为，AGAP1功能缺陷可能使细胞易受“二次打击”的细胞毒性影响，这为基因-环境相互作用提供了潜在的机制解释。

Genes in neuroinflammatory pathways

具有最大负β系数的iDMC位于SLC15A4基因的最后一个内含子内。SLC15A4是一种位于内溶酶体膜上的氨基酸转运蛋白，已知与NLRP炎症小体蛋白相互作用。此外，数据集中还包含了其他参与炎症小体激活和神经炎症通路的基因，如TNFSF11、NFKBID、IL16、CCR5和CCRL2。CCR5和CCRL2与STK39一同被注释到“趋化因子介导的信号通路”这一GO条目中。这些发现提示，神经炎症通路相关基因的表观遗传调控可能在PD中扮演重要角色，尤其是考虑到炎症小体作为基因-环境相互作用介质以及作为PD治疗靶点的近期研究兴趣。

Genes in lipid biosynthesis and homeostasis pathways

研究还发现了与脂质生物合成和稳态通路相关的基因存在表观遗传改变。例如，在AGPAT4、LIPC和PLD1等编码脂质合成酶的基因内部或邻近的增强子区域鉴定出iDMC。这三个基因均被注释到“磷脂酸代谢过程”和“磷脂酸生物合成过程”的GO条目中。脂质代谢紊乱在神经退行性疾病中的作用日益受到关注，这些表观遗传变化可能通过影响神经元膜的组成和功能参与PD病理。

Imprinted genes

研究还关注了印记基因的表观遗传改变。在复杂的印记基因GNAS位点发现了一个iDMC，该位点编码刺激性G蛋白的α亚基，其印记状态对发育和G蛋白偶联受体介导的神经递质信号传导至关重要。该iDMC位于一个双价启动子和推测的印记控制区内，其失衡可能影响该位点的印记状态和转录本表达。另一个印记基因RB1（RB转录辅抑制因子1）的增强子区也发现了一个iDMC，显示5hmC相对增加和5mC相对减少。RB1在神经系统中的作用研究表明，它对于有丝分裂后神经元的存活至关重要，其表观遗传失调可能导致神经元通过细胞周期重新进入和衰老而丢失。

Genes identified in our model of increased PD susceptibility

值得注意的是，本研究中发现的多个基因（AGAP1, APC2, GNAS, ELANE, WWOX）也在研究者先前建立的环境诱导PD易感性增加的“二次打击”小鼠模型中被鉴定出存在DNA修饰改变。该模型表明，发育期暴露于有机氯农药狄氏剂会导致雄性小鼠在α-突触核蛋白预制原纤维模型中特异性加剧神经毒性。这些基因在模型与人类PD之间的共享，提示涉及神经发育、突触建立与维持的机制可能为晚发性神经系统疾病易感性的增加奠定了基础。

讨论

这项研究首次在PD患者死后顶叶皮层富集的神经元中，应用混合效应模型对5mC和5hmC进行了整合的全基因组分析。该区域在PD中期病理较晚出现，神经元丢失不显著，为研究病理前期的基因调控变化提供了窗口。研究发现，PD相关的iDMC与之前仅基于BS的EWAS所鉴定的差异甲基化位点有显著不同，仅有7个基因重叠，这强有力地表明5mC和5hmC之间的动态转换在PD病因学中扮演着重要但此前未被认识的角色，而这种变化无法通过单独分析BS数据捕捉到。

研究揭示了多个与PD发病机制相关的关键通路存在表观遗传失调，特别是内溶酶体运输和LRRK2介导的通路。LRRK2是家族性PD中最常突变的基因，其常见变异也与散发性PD相关。AGAP1和RAB32等LRRK2相互作用基因的表观遗传调控，可能代表了遗传和环境风险因素之间的机制联系。此外，神经炎症通路（如SLC15A4及相关基因）和脂质代谢通路基因的表观遗传改变，为理解PD中的神经炎症和代谢紊乱提供了新视角。印记基因（如GNAS和RB1）对环境扰动高度敏感，其表观遗传失调可能是早期环境暴露影响晚年疾病风险的潜在机制。

尽管由于样本量限制，对性别差异的深入分析有限，但针对男性中发现的iDMC在女性样本中的初步分析显示，约25%的位点也显示出差异，且其中大部分变化方向相反，这与PD中存在的明确性别差异一致，提示表观遗传调控可能是这些差异的基础。

本研究也存在一些局限性。Illumina EPIC芯片并非真正的全基因组覆盖，可能遗漏一些重要区域。由于oxBS技术对DNA起始量的要求较高，且与BS处理在不同批次的细胞核分离物上进行，引入了无法完全控制的批次效应和技术变异。此外，研究未能直接评估这些表观遗传变化的功能后果。未来的研究需要利用位点特异性靶向分析、单细胞多组学技术等手段，进一步探索这些变化对基因表达、转录本选择以及神经元功能的直接影响。

总之，这项工作突破了传统DNA甲基化研究的局限，通过创新性地同时建模5mC和5hmC，揭示了PD大脑神经元中此前隐藏的表观遗传景观。它不仅扩展了我们对PD相关基因和通路网络的认识，指出了新的潜在机制，更重要的是，它凸显了在表观遗传学研究中区分并整合分析不同DNA修饰标记的必要性。这些发现为理解基因-环境相互作用在复杂神经退行性疾病中的机制提供了宝贵资源，并为未来开发新的干预策略指明了方向。