USP1通过调控HELLS去泛素化与SUMO化双重作用驱动EMT及FOLFOX化疗耐药的新机制

《Oncogenesis》：Dual roles of USP1 in HELLS deubiquitination and SUMOylation drive EMT and FOLFOX-based chemoresistance

本研究针对肝细胞癌（HCC）患者接受FOLFOX方案（含奥沙利铂和5-FU）化疗后易产生耐药性这一临床难题，深入探讨了去泛素化酶USP1在其中的关键作用。研究人员发现USP1通过去泛素化稳定染色质重塑因子HELLS，并通过稳定SUMO连接酶PIAS1促进HELLS的SUMO化修饰，从而协同促进上皮-间质转化（EMT）和同源重组修复（HRR），最终导致化疗耐药。该研究不仅揭示了USP1/HELLS轴在HCC进展及化疗耐药中的新机制，还为提高HAIC-FOLFOX疗效提供了潜在治疗靶点。

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。由于早期症状不明显，许多患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会。对于这些患者，肝动脉灌注化疗（HAIC）联合FOLFOX方案（包含氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利铂）已成为一种重要的治疗选择。尽管该方案在部分患者中显示出较好的疗效，但化疗耐药问题依然突出，严重限制了其临床应用效果。因此，深入探索HCC化疗耐药的分子机制，寻找有效的增敏策略，具有重要的临床意义。

在这项发表于《Oncogenesis》的研究中，研究人员聚焦于去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes, DUBs）家族成员——泛素特异性蛋白酶1（USP1），系统阐述了其在HCC进展和FOLFOX化疗耐药中的双重调控作用。通过对多个生物信息学数据库和本地HCC队列的分析，研究人员发现USP1在HCC组织中显著高表达，且与患者不良预后密切相关。功能实验表明，USP1过表达能够促进HCC细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）等恶性表型；而使用USP1特异性抑制剂ML323或利用短发夹RNA（shRNA）敲低USP1表达，则能抑制这些恶性行为，并增强HCC细胞对奥沙利铂和5-FU的敏感性。进一步的机制研究显示，USP1通过与染色质重塑因子HELLS直接相互作用，去除了其上的泛素链，从而稳定了HELLS的蛋白水平，抑制了其通过蛋白酶体途径的降解。有趣的是，研究人员还发现USP1能够通过去泛素化稳定SUMO E3连接酶PIAS1，进而促进HELLS的SUMO化修饰。这种双重修饰（去泛素化和SUMO化）共同增强了HELLS的稳定性及其功能，最终促进了EMT和同源重组修复（Homologous Recombination Repair, HRR）过程，导致化疗耐药。体内实验进一步证实，联合使用ML323与化疗药物能够显著抑制移植瘤的生长，增强化疗疗效。该研究不仅揭示了USP1/HELLS轴在HCC化疗耐药中的关键作用，也为克服HAIC-FOLFOX耐药提供了新的潜在治疗策略。

研究人员在开展本研究时，综合运用了多种关键技术方法。在临床样本分析方面，研究纳入了115例本地HCC患者组织样本以及来自TCGA、ICGC等多个公共数据库的HCC队列数据。在分子机制探索层面，采用了4D标记定量液相色谱-质谱联用（4D Label-free LC-MS/MS）技术筛选USP1的潜在作用底物；通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）、免疫荧光（Immunofluorescence, IF）、蛋白质半衰期测定、泛素化分析等实验验证了USP1与HELLS、PIAS1之间的相互作用及修饰调控；利用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、克隆形成、Transwell迁移、伤口愈合实验等评估细胞增殖、迁移能力及化疗敏感性；通过彗星实验（Comet Assay）、γ-H2AX和RAD51焦点形成实验检测DNA损伤与修复；并利用裸鼠移植瘤模型进行体内药效验证。

USP1是HCC的驱动基因

通过对88个HCC队列中DUBs家族成员表达谱的系统分析，研究人员发现包括USP1在内的13个DUBs在超过70%的队列中呈现差异表达。生存分析显示，仅有USP1和USP13的表达与HCC患者的不良预后显著相关。进一步分析表明，USP1的表达水平与肿瘤的病理分期、组织学分级以及转移状态显著相关，且在单细胞测序数据中主要富集于HCC细胞和晚期样本中。本地115例HCC队列的免疫组织化学染色及生存分析同样证实，USP1高表达是患者预后不良的独立危险因素。这些结果提示USP1可能是HCC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

USP1增强HCC细胞的侵袭性

功能实验表明，利用ML323抑制USP1活性或通过shRNA敲低USP1表达，均可显著抑制HCC细胞的增殖、克隆形成和迁移能力；反之，过表达USP1则能增强Huh7细胞的这些恶性表型。进一步的研究发现，USP1高表达的HCC病例具有更高的EMT评分。基因集富集分析（GSEA）及相关性分析均提示USP1参与EMT过程的调控。免疫荧光和蛋白质印迹（Western Blotting）结果证实，USP1能够正向调控间质标志物Vimentin和N-cadherin的表达，负向调控上皮标志物E-cadherin的表达。这些结果表明USP1通过促进EMT进而增强HCC细胞的侵袭能力。

USP1通过介导EMT和HRR调控肝癌化疗敏感性

基因集变异分析（GSVA）显示，USP1的表达与DNA损伤和DNA修复通路呈最高正相关。GSEA和GO/KEGG富集分析也表明，USP1高表达的病例富集于DNA损伤应答、DNA修复、DNA双链断裂修复等相关通路。研究人员随后评估了USP1对FOLFOX方案核心药物奥沙利铂和5-FU敏感性的影响。结果表明，在相对耐药的SK-Hep1细胞中，ML323能够增强奥沙利铂和5-FU诱导的生长抑制效应，降低细胞活力并减少克隆存活；而在敏感的Huh7细胞中，过表达USP1则能减弱这两种药物的抑制作用。联合用药可显著增加DNA损伤标志物γ-H2AX的表达，彗星实验也证实联合处理加剧了DNA损伤。此外，USP1的缺失减少了化疗后细胞核内RAD51的招募，而过表达USP1则能增加RAD51的招募并部分逆转这一减少。蛋白质水平检测同样发现，敲低USP1可降低RAD51蛋白表达，而过表达USP1则能上调其表达。这些数据说明USP1可能通过调控HRR影响HCC细胞对化疗药物的敏感性。

USP1与HELLS相互作用并共定位

为了探寻USP1的下游作用底物，研究人员利用4D标记定量蛋白质组学技术分析了ML323处理后的差异表达蛋白质。结果显示，染色质重塑因子HELLS是受ML323处理下调最显著的蛋白之一。生物信息学分析表明，HELLS在HCC组织中表达上调，且与晚期分期、高级别及患者不良预后相关。分子对接预测了USP1与HELLS之间存在相互作用，免疫荧光和内源性Co-IP实验证实了二者在HCC细胞中存在共定位和直接结合。通过构建USP1截短体突变体并进行Co-IP实验，进一步确定USP1的C端（401-785氨基酸）区域负责与HELLS的结合。

USP1通过去泛素化途径稳定HELLS蛋白表达

作为去泛素化酶，USP1可能通过去泛素化调控HELLS的蛋白稳定性。环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，抑制USP1活性或敲低USP1表达会显著缩短HELLS蛋白的半衰期；而过表达USP1则能稳定HELLS表达，减缓其降解。蛋白酶体抑制剂MG132处理能够逆转ML323或shUSP1对HELLS表达的抑制作用。催化失活型USP1突变体（C90S）无法像野生型USP1那样增加HELLS的表达。泛素化分析显示，遗传或药理学手段抑制USP1均能显著增加HELLS的泛素化水平；而野生型USP1，而非C90S突变体，则能下调HELLS的泛素化。进一步研究发现，ML323主要增强了HELLS的K48连接的多聚泛素化，而K63连接则无明显影响，提示USP1主要通过抑制HELLS的K48连接的多聚泛素化来稳定其蛋白水平。

USP1通过稳定HELLS蛋白介导EMT和DNA损伤修复应答

研究人员随后探讨了HELLS是否介导了USP1调控的EMT和HRR。结果表明，敲低或抑制USP1可负向调控EMT标志物的表达，而过表达HELLS能够逆转这一效应。同样，HELLS的过表达也恢复了因USP1沉默或抑制而降低的Vimentin、N-cadherin的免疫荧光强度，以及E-cadherin的表达，并挽救了被抑制的细胞迁移能力。在化疗药物存在下，ML323或敲低USP1所引起的γ-H2AX水平升高和RAD51水平降低，可被HELLS过表达所逆转。彗星实验及γ-H2AX和Rad51焦点的免疫荧光观察进一步证实了HELLS在USP1介导的化疗相关HRR中的调控作用。这些数据明确了HELLS在USP1调控的EMT和DNA损伤修复应答中的关键角色。

USP1通过去泛素化稳定PIAS1进而促进HELLS的SUMO化

研究发现，在HEK-293T细胞中，HELLS能够与SUMO1、SUMO2和SUMO3发生相互作用，其中与SUMO1的结合最强。USP1能够显著增强HELLS的SUMO化修饰，特别是在Huh7细胞中促进了SUMO1介导的HELLS SUMO化。蛋白质组学数据提示，E3 SUMO连接酶PIAS1在ML323处理后表达显著下调。进一步实验证实，USP1的表达与PIAS1蛋白水平呈正相关，敲低USP1会降低PIAS1表达，而MG132处理可逆转此效应。CHX追踪实验显示USP1敲低加速了PIAS1的降解，而过表达USP1则增加了其稳定性。Co-IP实验证明USP1可直接与PIAS1结合，并调控其泛素化水平。功能上，USP1过表达所促进的HCC细胞EMT、增殖和迁移，可被SUMO化抑制剂TAK981或PIAS1敲低所显著减弱，表明USP1的效应部分依赖于PIAS1介导的SUMO化。

ML323联合化疗的体内疗效及USP1/HELLS轴的临床意义

在裸鼠移植瘤模型中，单独使用奥沙利铂或5-FU可抑制肿瘤生长，而联合ML323则能进一步增强这种抑制作用，表现出协同抗肿瘤效果。免疫组织化学染色显示，ML323处理下调了移植瘤组织中Ki67、RAD51、N-cadherin、HELLS和Vimentin的表达，同时上调了E-cadherin和γ-H2AX的表达。对TCGA-LIHC和GSE27150数据集的分析发现，USP1和HELLS均高表达的HCC患者总生存期最差。这些结果在体内水平验证了靶向USP1能够增敏FOLFOX化疗，并提示USP1/HELLS轴具有重要的临床预后价值。

本研究系统阐明了USP1在HCC进展和FOLFOX化疗耐药中的关键作用及其分子机制。研究人员发现USP1通过去泛素化直接稳定HELLS蛋白，同时通过去泛素化稳定PIAS1间接促进HELLS的SUMO化修饰。这种双重修饰共同增强了HELLS的稳定性及其功能，进而促进EMT过程和HRR能力，最终导致HCC细胞的侵袭性增强和对化疗药物的抵抗。该研究不仅揭示了USP1/HELLS调控轴在HCC中的新功能，更重要的是，为克服HAIC-FOLFOX化疗耐药提供了新的理论依据和潜在的联合治疗策略（USP1抑制剂如ML323联合化疗）。这一发现对于改善晚期HCC患者的治疗效果和预后具有重要的转化医学意义。