CCR2信号轴调控巨噬细胞与胰腺癌细胞相互作用影响肿瘤微环境并抑制胰腺癌进展

《Scientific Reports》：Blockade of CC chemokine receptor 2 suppresses pancreatic cancer progression through the interaction with macrophages in the tumor microenvironment

本研究针对胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤微环境（TME）中基质细胞与肿瘤细胞相互作用的复杂机制，聚焦CC趋化因子受体2（CCR2）在巨噬细胞中的功能。研究人员通过基因敲除模型发现，巨噬细胞通过CCR2依赖性方式促进PDAC细胞侵袭，而CCR2缺失可诱导巨噬细胞表型向M1样转化并上调干扰素-α（IFN-α）表达，进而通过激活STAT1信号通路促进肿瘤细胞凋亡。该研究揭示了CCR2信号轴在PDAC进展中的关键作用，为靶向肿瘤微环境的治疗策略提供了新思路。

　　

胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌（PDAC），因其极差的预后和不断上升的发病率，已成为全球性的健康挑战。其五年生存率极低，治疗手段有限。超过95%的PDAC病例存在KRAS基因突变，同时伴随其他关键肿瘤抑制基因的失活，共同驱动肿瘤的发生与发展。PDAC的一个显著特征是富含大量基质的肿瘤微环境（TME），其中浸润的各种免疫细胞和基质细胞与肿瘤细胞之间存在着复杂的相互作用，这种相互作用深刻影响着肿瘤的进展、侵袭和对治疗的反应。在TME的众多细胞类型中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）受到了广泛关注。巨噬细胞通常被分为具有抗肿瘤活性的M1型和具有促肿瘤活性的M2型。在PDAC中，M2型巨噬细胞往往占主导地位，通过免疫抑制和促进血管生成等方式支持肿瘤生长。

趋化因子信号通路在免疫细胞向肿瘤部位的招募过程中扮演着关键角色。此前的研究，包括本文作者团队的工作，已经揭示了CXC趋化因子及其受体CXCR2轴在PDAC的肿瘤-基质相互作用中发挥促癌作用。然而，另一大类趋化因子——CC趋化因子，特别是其关键受体CC趋化因子受体2（CCR2）在PDAC TME中的具体功能，尤其是其对巨噬细胞自身特性以及巨噬细胞与PDAC细胞相互作用的调控机制，尚不完全清楚。为了解决这一问题，研究人员利用能够很好模拟人PDAC病理特征的基因工程小鼠模型（PKF小鼠，即Ptf1a^cre/+; LSL-Kras^G12D/+; Tgfbr2^flox/flox小鼠），深入探究了CCR2在PDAC进展中的作用及其分子机制。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

本研究主要运用了多种关键技术方法。包括使用基因工程小鼠模型（PKF及PKFC小鼠）进行体内生存分析和组织学评估；通过骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的诱导培养进行体外功能研究；利用细胞侵袭实验、细胞增殖/凋亡检测、蛋白质印迹、定量PCR、细胞因子阵列、RNA测序及基因集富集分析（GSEA）探究分子机制；并通过免疫组织化学/免疫荧光染色对小鼠肿瘤组织中的细胞浸润、表型、信号通路激活及微血管侵犯等进行定量分析。

CC趋化因子在癌相关成纤维细胞中的表达上调

研究人员重新分析了既往的cDNA微阵列数据，发现小鼠PDAC细胞的条件培养基能够刺激小鼠癌相关成纤维细胞（mCAF）中多种CC趋化因子（如Ccl2, Ccl7）的表达显著上调，且信号强度高于CXC趋化因子。这提示CC趋化因子在PDAC的TME中含量丰富，可能发挥重要作用。

CCR2在胰腺癌微环境巨噬细胞中表达

通过免疫组织化学染色，研究发现CCR2蛋白在PKF小鼠的胰腺肿瘤组织中主要表达于基质区域，而在肿瘤上皮细胞中不表达。进一步的免疫荧光双标染色证实，CCR2与巨噬细胞标志物F4/80存在共定位，表明TME中的巨噬细胞表达CCR2。值得注意的是，也存在部分F4/80阳性而CCR2阴性的巨噬细胞亚群。

巨噬细胞以CCR2依赖性方式促进胰腺癌细胞侵袭

为了探究CCR2在巨噬细胞中的功能，研究从Ccr2野生型（WT）和全身性Ccr2敲除（KO）小鼠中诱导了骨髓来源巨噬细胞（BMDM）。体外实验表明，Ccr2 WT BMDM的条件培养基能显著促进mPDAC细胞的侵袭能力，而Ccr2 KO BMDM的条件培养基则显著削弱了这种促侵袭作用。然而，两种BMDM的条件培养基对mPDAC细胞或mCAF的增殖均无显著影响。这表明巨噬细胞通过CCR2依赖性机制促进PDAC细胞的侵袭，而非增殖。

CXC趋化因子参与巨噬细胞诱导的胰腺癌侵袭

为了阐明机制，研究人员通过细胞因子阵列和qRT-PCR比较了Ccr2 WT和KO BMDM的分泌谱。发现Ccr2 KO BMDM中多种细胞因子表达下调，其中包括CXC趋化因子Cxcl2和Cxcl5（均为CXCR2的配体）。在侵袭实验中，加入CXCR2抑制剂SB225002能够逆转Ccr2 WT BMDM条件培养基对mPDAC细胞的促侵袭作用。这表明巨噬细胞通过CCR2依赖性方式产生CXC趋化因子，进而通过CXCLs-CXCR2轴促进PDAC细胞侵袭。

Ccr2敲除延长胰腺癌小鼠生存期

为了在体内验证CCR2的功能，研究人员构建了在PKF小鼠背景上全身性敲除Ccr2的小鼠模型（PKFC小鼠）。生存分析显示，PKFC小鼠的中位生存时间（80.5天）较PKF小鼠（58天）显著延长。这表明系统性阻断CCR2能够有效抑制PDAC进展，改善预后。

Ccr2缺失改变TME巨噬细胞组成并抑制血管侵袭同时增加癌细胞凋亡

对胰腺肿瘤的组织学分析发现，尽管两组小鼠的肿瘤重量、瘤间质比例以及肿瘤细胞增殖指数（Ki-67）无显著差异，但PKFC小鼠的TME发生了重要变化。免疫染色显示，PKFC小鼠肿瘤交界区基质中，M1样巨噬细胞标志物iNOS阳性细胞显著增加，而M2样巨噬细胞标志物Arginase-1阳性细胞显著减少，但总巨噬细胞（F4/80阳性）数量无变化，提示巨噬细胞表型由促瘤的M2样向抑瘤的M1样转变。此外，PKFC小鼠肿瘤中的静脉微侵犯显著减少，淋巴管侵犯也有下降趋势。同时，肿瘤上皮细胞中的凋亡标志物Cleaved Caspase-3阳性细胞显著增加。这些变化可能是生存期延长的原因。

Ccr2敲除巨噬细胞通过激活干扰素-α信号诱导胰腺癌细胞凋亡

体外凋亡实验证实，Ccr2 KO BMDM的条件培养基能直接诱导mPDAC细胞发生更高水平的凋亡。对经BMDM条件培养基处理后的mPDAC细胞进行RNA测序分析，基因本体论分析和GSEA均显示，干扰素-α信号通路被显著激活。Western blotting证实，与Ccr2 WT BMDM相比，Ccr2 KO BMDM刺激的mPDAC细胞中磷酸化STAT1和总STAT1蛋白水平上调。进一步研究发现，Ccr2 KO BMDM本身高表达Ifn-α和Ifn-β。使用IFN-α激动剂可直接诱导mPDAC细胞凋亡。在体实验也证实，PKFC小鼠肿瘤上皮中STAT1表达上调，且肿瘤内巨噬细胞产生IFN-α的比例更高。这些结果说明，CCR2的缺失解除了对巨噬细胞I型干扰素（特别是IFN-α）表达的抑制，增加的IFN-α进而通过激活PDAC细胞中的STAT1信号通路，诱导其凋亡。

本研究深入揭示了CCR2信号轴在PDAC肿瘤微环境中的关键作用。它阐明了巨噬细胞通过CCR2依赖性机制促进肿瘤侵袭的双重路径：一方面，活化的巨噬细胞产生CXC趋化因子，通过CXCR2轴促进PDAC细胞侵袭；另一方面，CCR2的阻断可重塑巨噬细胞表型，并激发其产生IFN-α，进而通过激活STAT1信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。在自发性PDAC小鼠模型中，全身性Ccr2敲除实现了显著的生存获益，这与其改变TME免疫格局、抑制肿瘤血管侵犯和促进肿瘤细胞死亡密切相关。该研究不仅深化了对PDAC肿瘤-基质相互作用复杂网络的理解，更重要的是，为将CCR2作为PDAC治疗新靶点提供了坚实的临床前证据。考虑到直接使用I型干扰素治疗存在毒性问题，通过靶向CCR2间接激活肿瘤内的干扰素信号通路，可能成为一种更具潜力的治疗策略，尤其在与现有免疫疗法或化疗联合时可能展现协同效应。