一株新型温和Coventryvirus噬菌体vB_SpsS_VL4的基因组与功能特征及其抗犬源耐甲氧西林伪中间葡萄球菌(MRSP)生物膜活性研究

《Scientific Reports》：Genomic and functional characterization of a novel temperate Coventryvirus phage infecting Staphylococcus pseudintermedius

本研究针对日益严重的耐甲氧西林伪中间葡萄球菌(MRSP)感染问题，分离并系统表征了一株新型温和Coventryvirus噬菌体vB_SpsS_VL4。该噬菌体对87%的临床MRSP分离株具有裂解活性，能有效抑制生物膜形成并部分降解成熟生物膜，基因组分析显示其不含毒力及耐药基因，为开发针对多重耐药MRSP感染的替代疗法提供了有前景的候选株。

　　

在兽医临床和公共卫生领域，伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudointermedius)作为一种重要的机会性病原体，尤其在犬类中常引起皮肤、软组织和手术部位感染。然而，更严峻的挑战来自于其耐甲氧西林菌株(Methicillin-Resistant Staphylococcus pseudointermedius, MRSP)的出现和流行。MRSP不仅对β-内酰胺类抗生素（如甲氧西林）耐药，通常还表现出多重耐药性，对氟喹诺酮类、大环内酯类、林可酰胺类等多种常用抗菌药物均不敏感，极大地限制了治疗选择。更棘手的是，MRSP具备强大的生物膜(Biofilm)形成能力。生物膜是细菌附着于生物或非生物表面后，自身分泌多糖基质包裹形成的结构化微生物群落。处于生物膜中的细菌，其对抗菌药物的耐受性可提高10-1000倍，并能逃避宿主免疫系统的清除，从而导致慢性、复发性感染，例如与植入物（如骨科内固定物）相关的感染极难根治。此外，MRSP是一种人畜共患病原体，与宠物密切接触的兽医、宠物主人等存在感染风险，这对“同一健康”(One Health)构成了威胁。面对抗生素耐药性危机，噬菌体(Bacteriophage)疗法作为一种有前景的替代方案重新受到关注。噬菌体是能够特异性感染并裂解细菌的病毒。与传统抗生素广谱杀菌、易破坏正常菌群不同，噬菌体具有高度的宿主特异性，能精准靶向致病菌。噬菌体可分为烈性噬菌体(Lytic phage)和温和噬菌体(Temperate phage)。烈性噬菌体感染后立即进入裂解循环，最终摧毁宿主细胞，是理想的治疗候选者。而温和噬菌体则有两种生命周期：裂解循环和溶原循环(Lysogeny)。在溶原循环中，噬菌体基因组会整合到宿主细菌的染色体上，以前噬菌体(Prophage)形式潜伏，随细菌分裂而遗传，在一定条件下（如环境压力）可被诱导进入裂解循环。由于温和噬菌体可能通过溶原化整合细菌毒力基因或耐药基因，存在水平基因转移的风险，传统上不被考虑用于治疗。但随着合成生物学的发展，对温和噬菌体进行基因工程改造，剔除其溶原相关基因，使其转变为专性裂解噬菌体已成为可能，并展现出协同抗菌等潜力。目前，针对伪中间葡萄球菌的噬菌体研究相对有限，特别是温和噬菌体的基因组和功能数据较为缺乏。为了填补这一空白，寻找具有广谱宿主范围和抗生物膜活性的新型噬菌体资源，Patoo Withatanung、Varintip Lerdsittikul等研究人员从污水中分离到一株新型温和噬菌体，并对其进行了全面的基因组和功能表征，相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

为开展本研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，从泰国曼谷的城市污水样本中，以临床分离的MRSP菌株MRSP-HVL4为宿主，通过富集培养和双层琼脂平板法分离纯化噬菌体。其次，利用透射电子显微镜观察噬菌体形态，并通过Illumina平台进行全基因组测序，利用生物信息学工具（如RAST, PHASTEST, VIRIDIC, VICTOR, ViPTree）进行基因组注释、比较基因组学和系统发育分析以确定其分类地位。再者，通过体外实验评估噬菌体的生物学特性，包括一步生长曲线测定潜伏期和裂解量、宿主范围及相对效率铺斑、在不同温度和pH下的稳定性、以及对浮游菌和生物膜（包括抑制形成和降解已形成生物膜）的杀菌效果。研究所用的31株伪中间葡萄球菌和10株金黄色葡萄球菌临床分离株来源于犬猫诊断样本。

结果

S. pseudointermedius临床分离株的抗生素耐药性和生物膜形成

对31株伪中间葡萄球菌临床分离株进行药敏试验，结果显示对苄青霉素耐药率最高(96.77%)，其次是苯唑西林(80.64%)，恩氟沙星和马波沙星(均为74.19%)。此外，所有测试菌株均具有生物膜形成能力，其中21株(67.74%)为强生物膜生产者。

MRSP菌株HVL4的特征：一个用于分离靶向高风险MRSP噬菌体的代表性宿主

通过丝裂霉素C诱导实验筛选适合噬菌体分离的宿主菌，发现MRSP-HVL4能抵抗丝裂霉素C诱导的裂解，全基因组测序显示其含有一个属于Fibralongavirus属的非诱导性或需特定条件诱导的前噬菌体，且MLST分型为ST45（流行克隆），表明其可作为分离靶向临床相关MRSP菌株噬菌体的合适宿主。

噬菌体VL4：Caudoviricetes纲的一员

从污水中分离得到一株能感染MRSP-HVL4的噬菌体，命名为vB_SpsS_VL4 (VL4)。该噬菌体在双层琼脂平板上形成约1毫米、中心透明的牛眼状浑浊噬菌斑。透射电镜显示VL4具有二十面体头部（直径60纳米）和长的非收缩性尾部（长度165纳米），属于有尾噬菌体纲(Caudoviricetes)。

噬菌体VL4是Coventryvirus属的一个新成员

VL4基因组为双链DNA，全长39,788 bp，GC含量35.5%。BLASTn和VIRIDIC分析表明，VL4与Coventryvirus属成员具有最高78.3%的核苷酸相似性（与噬菌体SpT152），低于ICTV用于界定新物种的95%阈值。VICTOR和ViPTree进行的基因组和蛋白组系统发育分析均支持VL4为Coventryvirus属内的一个新物种。

噬菌体VL4的功能基因组特征

PhageTerm分析提示VL4可能采用headful (pac型)包装机制，基因组线性、环状排列且末端冗余。注释共预测到68个开放阅读框(ORFs)，分属DNA包装、头尾组装、DNA复制与代谢、宿主裂解、溶原以及功能未知蛋白等6个功能模块。未检测到tRNA、耐药基因、毒力因子或毒素基因。裂解模块包含一个具有CHAP结构域的双功能自溶素和推定的裂解酶和穿孔素。比较基因组分析显示VL4与相近噬菌体在整合酶、终止酶大亚基等基因上存在变异。

噬菌体VL4的整合能力和溶原性

基因组中发现整合酶、阻遏蛋白、抗阻遏蛋白等溶原相关基因，以及预测的细菌附着位点attL和attR。PhageAI预测其为温和噬菌体（置信度99.84%）。实验验证发现，用VL4感染MRSP-HVL4后获得的抗性菌落中，部分能通过PCR稳定检测到VL4主要衣壳蛋白基因，且能传代五次，证实了VL4能建立稳定的溶原状态。其余抗性菌落未检测到噬菌体DNA，但依然抗感染，宿主菌基因组分析提示可能存在限制修饰系统等细菌防御机制。

噬菌体VL4的生物学特性

VL4的最佳感染复数(MOI)为0.01。吸附实验显示，10分钟内超过80%的噬菌体颗粒吸附到宿主细胞。一步生长曲线显示潜伏期约50分钟，平均裂解量为56 PFU/细胞。VL4在中性pH和37°C下稳定，在极端pH和高温（≥60°C）下失活。表明其在生理条件下短期稳定。

噬菌体VL4的宿主范围和相对效率铺斑

VL4对31株伪中间葡萄球菌中的27株(87%)有裂解活性（产生清晰或浑浊斑），但对10株金黄色葡萄球菌无活性。相对效率铺斑显示，对敏感菌株的感染效率不同。4株不被裂解的菌株在感染前其基因组PCR检测即呈VL4衣壳蛋白基因阳性，提示它们可能已携带VL4样前噬菌体，从而产生超感染免疫。

噬菌体VL4对伪中间葡萄球菌临床分离株的溶菌活性

以MOI为0.1和1感染4株具有强生物膜形成能力的临床分离株（MRSP-HVL4, MRSP-BA04, MRSP-BA05, MSSP-BA28），VL4能显著抑制细菌生长达16小时，且在感染早期（4小时内）即可观察到光密度迅速下降，呈现剂量依赖性效应。

噬菌体VL4抑制并破坏伪中间葡萄球菌生物膜

在生物膜形成过程中，共孵育不同滴度（10⁷, 10⁸, 10⁹PFU/mL）的VL4，可剂量依赖性地减少生物膜生物量，最高浓度下抑制率达70-90%，活菌计数也相应降低。对于预形成的24小时生物膜，使用高滴度（10⁸, 10⁹, 10¹⁰PFU/mL）VL4处理24小时，可显著减少生物膜生物量和活菌数（最大减少约0.9 log CFU/mL），表明其对成熟生物膜具有部分降解能力。

讨论与结论

本研究成功分离并全面表征了一株新型温和噬菌体VL4，它属于Coventryvirus属的新物种。尽管其温和特性使其存在溶原化和潜在基因转移风险，但VL4展现出诸多令人鼓舞的治疗潜力特征：首先，它对绝大多数测试的伪中间葡萄球菌临床分离株（87%）具有裂解活性，且特异性高，不攻击金黄色葡萄球菌，有利于减少对正常菌群的干扰。其次，VL4基因组不含已知毒力、耐药基因或tRNA，安全性 profile 较好。第三，也是其突出优势，VL4不仅能有效裂解浮游状态的MRSP，还能剂量依赖性地抑制生物膜形成并对已形成的成熟生物膜产生显著的降解作用，这对于治疗与生物膜相关的慢性MRSP感染（如伤口感染、植入物感染）具有重要意义。其抗生物膜机制可能主要归因于其编码的含有CHAP结构域的裂解酶和穿孔素介导的细菌裂解，从而间接破坏生物膜结构。

研究也指出了VL4的局限性及应用前景。其温和本性是治疗应用的主要障碍，可能导致溶原化菌株存活并获得超感染免疫力。未来的研究可通过基因工程手段敲除其溶原相关基因（如整合酶），将其改造为专性裂解噬菌体，以消除溶原化风险。此外，需在更接近体内环境的模型（如流动细胞生物膜模型、动物感染模型）中进一步验证其疗效，并实验评估其转导潜力。将VL4与其他噬菌体或抗生素组合成鸡尾酒疗法，也是克服耐药性、增强疗效的策略。

总之，噬菌体VL4作为一种新型Coventryvirus噬菌体，具备对抗多重耐药、强生物膜形成能力的MRSP的显著潜力。尽管其温和特性需要进一步工程化改造以确保临床应用的安全性，但本研究为其后续开发奠定了坚实的理论基础，为应对日益严峻的兽医学及潜在人医领域的MRSP感染提供了有希望的替代治疗候选者。