铁死亡驱动的M2巨噬细胞通过调控子宫平滑肌收缩促进分娩发动的机制研究

《Scientific Reports》：M2 macrophages undergoing ferroptosis regulate uterine smooth muscle contraction to facilitate labor onset

本研究针对分娩发动机制不清的难题，聚焦M2巨噬细胞铁死亡（ferroptosis）在子宫免疫微环境调控中的作用。通过多组学分析结合实验验证，发现分娩时M2巨噬细胞通过HMOX1介导的铁死亡途径分泌促炎因子，增强人子宫平滑肌细胞（HUSMCs）收缩功能。该研究为异常分娩时机提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

分娩发动是生殖生物学领域最精妙而复杂的过程之一，它涉及母胎互动、子宫收缩、蜕膜激活、宫颈成熟和胎膜破裂等多个环节的精确调控。尽管科学家对激素信号（如"功能性孕激素撤退"和前列腺素升高）及机械牵张等因素进行了深入研究，但分娩启动的具体分子机制仍不完全清楚。近年来，越来越多的证据表明，母体炎症和免疫反应参与了分娩的各个阶段，特别是在子宫从静止状态向收缩状态转变的过程中发挥着关键作用。

在妊娠晚期，大量免疫细胞浸润到子宫微环境中，通过分泌炎症细胞因子、基质降解酶和其他介质，促进组织重塑和子宫肌层的激活。其中，巨噬细胞作为关键的免疫调节细胞，在妊娠期的免疫耐受和分娩期的炎症反应中都扮演着重要角色。有趣的是，对人和小鼠子宫组织的分析表明，M2巨噬细胞在妊娠晚期占主导地位，但在分娩过程中减少，这支持了它们在维持子宫静止状态中的作用。

近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式引起了广泛关注。其特征是铁依赖的脂质过氧化和活性氧（ROS）的积累，被认为是连接铁代谢、氧化应激和炎症的重要环节。铁死亡已被证实与妊娠相关疾病中的胎盘功能障碍有关，如自然流产、子痫前期、妊娠期糖尿病、妊娠期肝内胆汁淤积症和自发性早产。最新研究表明，铁死亡与免疫细胞功能密切相关，可能通过促进巨噬细胞向M1表型极化和细胞因子分泌来影响体内平衡。然而，铁死亡在分娩发动过程中对子宫免疫调节的作用仍 largely unexplored（尚未探索）。特别是，M2巨噬细胞在分娩启动过程中是否发生铁死亡，以及这一过程是否影响子宫免疫微环境和平滑肌收缩，仍然是一个关键的研究空白。

基于此，哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科蔡燕教授团队在《Scientific Reports》上发表了题为"M2 macrophages undergoing ferroptosis regulate uterine smooth muscle contraction to facilitate labor onset"的研究论文。该研究提出创新性假设：发生铁死亡的M2巨噬细胞可能诱导局部子宫免疫环境从抗炎向促炎转变，从而增强子宫平滑肌细胞活化和收缩，进而促进分娩发动。

研究团队整合多个转录组数据集，对分娩发动过程中子宫肌层的免疫细胞浸润和关键免疫细胞亚群进行了深入分析，并系统鉴定了铁死亡相关差异基因（FRDGs）。通过生物信息学分析和实验验证，研究人员成功证明了分娩发动过程中M2巨噬细胞浸润减少和铁死亡相关差异基因血红素加氧酶1（HMOX1）表达升高，且两者之间存在显著的负相关关系。

关键技术方法概述

研究团队从GEO和ArrayExpress数据库获取五个子宫肌层转录组数据集，使用CIBERSORT和ssGSEA算法进行免疫细胞浸润分析，并通过LASSO回归识别特征性免疫细胞。从FerrDb V2数据库获取铁死亡相关基因（FRGs），与差异表达基因（DEGs）取交集获得铁死亡相关差异基因（FRDGs）。使用KEGG和GO数据库进行通路富集分析，通过String数据库构建蛋白质相互作用（PPI）网络。临床收集足月未临产（TNL）和足月临产（TL）组子宫肌层样本（n=39），通过体外培养人子宫平滑肌细胞（HUSMCs）和THP-1来源的M2巨噬细胞，使用Ferrostatin-1（Fer-1）和RSL3调控铁死亡过程，采用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、PCR阵列和胶原凝胶收缩实验等功能分析方法。

免疫浸润分析鉴定分娩发动过程中的核心免疫细胞

研究人员首先使用CIBERSORT算法对校正后的GSE163773和GSE186763数据集进行免疫分析，发现21种免疫细胞类型浸润子宫肌层。主成分分析（PCA）聚类和免疫细胞浸润差异分析显示，足月临产（TL）组与足月未临产（TNL）组的免疫浸润模式存在显著差异。差异分析鉴定出12种免疫细胞类型的浸润水平发生显著改变，包括TL组单核细胞和中性粒细胞显著增加，而M2巨噬细胞和活化NK细胞显著减少。通过LASSO回归进一步确定了与分娩发动相关的四种核心免疫细胞：活化NK细胞、M2巨噬细胞、活化树突状细胞和静止肥大细胞。这些发现在验证数据集GSE9159和E-MTAB-3136中得到了证实。

铁死亡相关基因和通路在分娩子宫肌层转录组谱中富集

差异表达分析共鉴定出1416个差异表达基因。与FerrDb数据库中的516个铁死亡相关基因（FRGs）取交集后，确定了49个铁死亡相关差异基因（FRDGs），包括32个上调基因和17个下调基因。KEGG通路富集分析显示，这些基因主要富集于铁死亡通路。功能聚类分析表明，FRDGs参与氧化应激、细胞金属离子转运和铁离子稳态等生物过程，提示铁死亡在分娩发动过程中起关键作用。

铁死亡相关蛋白构建PPI网络和分娩发动诊断模型

蛋白质相互作用（PPI）网络分析包含了23个节点基因和34个关系对。研究发现，促进分娩的基因如白细胞介素6（IL6）、白细胞介素1β（IL1B）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）位于网络的核心节点。经典铁死亡相关基因包括HMOX1、溶质载体家族40成员1（SLC40A1）、转铁蛋白受体（TFRC）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和溶质载体家族39成员14（SLC39A14）也被确定为关键节点基因。研究人员利用TFRC、HMOX1、SLC40A1和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）构建的分娩发动诊断模型表现出优异的分类能力，曲线下面积（AUC）达到0.987。

核心免疫细胞与关键铁死亡相关基因的相关性分析

相关性分析显示，M2巨噬细胞与SLC39A14、TFRC、ACSL4、IL1B、IL6和HMOX1存在不同程度的负相关，而与SLC40A1呈弱正相关。值得注意的是，当同时分析TL和TNL组时，只有HMOX1与M2巨噬细胞显示出显著的中等负相关。这一发现在验证数据集中也得到了证实，表明HMOX1可能通过调节M2巨噬细胞中的铁死亡过程在分娩发动中发挥重要作用。

人子宫平滑肌组织在分娩发动过程中铁死亡水平上调

对临床收集的人子宫平滑肌组织的分析显示，分娩发动时HMOX1、TFRC、ACSL4、SLC39A14和NFE2样bZIP转录因子2（NRF2）的mRNA表达升高，而SLC40A1和GPX4表达降低。蛋白表达分析结果一致，HMOX1、TFRC和ACSL4表达增加，SLC40A1和GPX4表达减少。铁死亡的特征性变化涉及脂质过氧化和铁代谢紊乱，研究人员发现与TNL组相比，TL组Fe²⁺水平升高，总谷胱甘肽（T-GSH）水平降低，丙二醛（MDA）含量升高，进一步证实了分娩发动过程中铁死亡的上调。

铁死亡调控HUSMCs表型变化

体外实验进一步研究了铁死亡对HUSMCs表型的影响。结果表明，与Fer-1处理相比，RSL3显著降低了分娩过程中关键缝隙连接蛋白连接蛋白43（CX43）的表达。细胞骨架重塑的变化显示，Fer-1处理诱导HUSMCs转变为三角形，代表分娩期间的肌细胞形态；而RSL3处理导致肌动蛋白丝沿细胞长度保持平行甚至聚集，抑制了细胞骨架重塑，导致HUSMCs呈现紧凑形态。这些发现表明，抑制铁死亡有助于HUSMCs激活为收缩状态，而铁死亡的发生抑制了这一过程。

铁死亡M2巨噬细胞增强HUSMCs收缩能力

基于初步数据分析，铁死亡相关基因与M2巨噬细胞在分娩发动过程中呈显著负相关。对人子宫肌层组织切片的免疫荧光分析显示，与TNL组相比，TL组中M2巨噬细胞标志物CD206显著减少。研究人员假设发生铁死亡的M2巨噬细胞可能释放促进HUSMCs收缩的促炎介质。为验证这一假设，将THP-1细胞分化为M2巨噬细胞，并用Fer-1或RSL3处理。流式细胞术检测M2巨噬细胞标志物CD206的结果显示，Fer-1促进M2细胞中CD206的高表达，而RSL3诱导CD206的低表达，表明铁死亡抑制M2巨噬细胞极化。人细胞因子和趋化因子PCR阵列结果显示，在RSL3处理的M2巨噬细胞中，促炎基因如IL1B、IL16、C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）和C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL2）的表达上调，而Fer-1处理抑制了免疫细胞招募相关基因（CCL2、CCL3）的表达。

胶原凝胶收缩实验评估了Fer-1、RSL3和铁死亡M2巨噬细胞对HUSMCs收缩能力的直接影响。结果显示，在胶原基质与孔壁分离后1、1.5和2小时，Fer-1处理的HUSMCs胶原凝胶面积显著小于铁死亡状态下的HUSMCs。重要的是，与铁死亡M2巨噬细胞共培养显著促进了收缩，与直接使用RSL3处理HUSMCs相比效果更明显。这些结果表明，在分娩发动过程中，铁死亡M2巨噬细胞更可能通过释放促炎介质间接促进HUSMCs收缩，而不是HUSMCs自身发生的铁死亡起主导作用。

研究结论与意义

该研究首次揭示了M2巨噬细胞可能是分娩过程中铁死亡的关键调节细胞群。由于铁死亡，M2巨噬细胞数量减少。在铁死亡诱导下，M2巨噬细胞表现出CD206表达减少，促炎细胞因子如IL1B和CXCL1显著上调，表明M2巨噬细胞向M1样表型转变。这种转变增强了局部炎症反应，促进子宫肌层活化和收缩。有趣的是，研究发现单独诱导HUSMCs铁死亡会抑制细胞骨架重塑和缝隙连接蛋白（CX43）表达，而铁死亡M2巨噬细胞通过分泌作用显著增强HUSMCs收缩，表明M2巨噬细胞可能通过铁死亡重塑炎症微环境来调节分娩发动，而不是通过平滑肌细胞自身的铁死亡。

该研究的创新点在于首次阐明了铁死亡在M2巨噬细胞中对分娩发动的潜在作用机制。研究发现铁死亡相关基因在分娩发动时的子宫肌层中显著富集，其中HMOX1与M2巨噬细胞呈负相关，表明HMOX1是M2巨噬细胞铁死亡的关键基因。研究人员提出，在巨噬细胞中，NRF2作为转录因子，当细胞发生氧化应激时，NRF2从细胞质转移到细胞核，与转录因子上的应激反应元件结合，导致HMOX1高表达，促进血红素降解，产生大量Fe²⁺并触发Fenton反应，这可能是M2巨噬细胞铁死亡的机制之一。

该研究不仅丰富了我们对分娩机制的理解，也为调节分娩时机和预防早产提供了潜在的新治疗靶点。然而，研究也存在一些局限性，如需要动物模型进一步验证M2巨噬细胞铁死亡的体内动力学，CIBERSORT基于外周血衍生的LM22特征矩阵可能无法完全反映子宫肌层中的组织驻留免疫细胞，以及针对铁死亡作为异常分娩时机的潜在干预措施的可行性需要临床前和临床研究的额外验证。

总之，这项研究表明，铁死亡M2巨噬细胞可能调节局部免疫微环境，促进子宫平滑肌收缩，从而启动分娩。这一发现为理解人类分娩发动的分子机制提供了新的视角，并为临床干预异常分娩时机提供了潜在靶点。