靶向TMPRSS4的siRNA脂质纳米颗粒联合5-FU抑制胃癌生长的实验研究

《Scientific Reports》：Delivery of lipid nanoparticles containing small interfering RNA targeting transmembrane serine protease 4 in a human gastric cancer model using nude mice

本研究针对胃癌患者TMPRSS4过表达导致化疗耐药的关键问题，开发了靶向TMPRSS4的siRNA脂质纳米颗粒（LNP）递送系统。研究发现LNP能有效富集于肿瘤组织，联合5-FU治疗可显著抑制小鼠胃癌模型肿瘤生长（487.4±331.7 mg vs 962.6±435.5 mg），并证实其通过下调TMPRSS4表达、上调E-cadherin发挥抗肿瘤作用，为胃癌靶向治疗提供新策略。

　　

在全球癌症负担中，胃癌始终是威胁人类健康的重要疾病。虽然手术切除是可手术胃癌的主要治疗方式，但大多数II期和III期患者需要各种辅助化疗来预防复发。早在2007年，ACTS-GC临床试验就证实，手术联合S-1术后辅助化疗相比单纯手术，可显著提高II期和III期胃癌患者的总生存率和无复发生存率。2019年，JACRO GC-07研究进一步表明，在多西他赛基础上加用S-1可改善III期胃癌患者的预后。然而，胃癌患者的治疗效果仍有提升空间，特别是针对化疗耐药的问题亟待解决。

近年来，研究发现跨膜丝氨酸蛋白酶4（TMPRSS4）的过表达与多种癌症类型相关，包括胰腺癌、结肠癌、胆道癌、肝细胞癌和胃癌。TMPRSS4通过促进E-钙黏蛋白下调，与上皮间质转化（EMT）和癌细胞侵袭密切相关。它还能通过与整合素α5相互作用激活AKT和ERK信号通路，进而诱导EMT和侵袭性。此外，TMPRSS4还调节尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），增强癌细胞侵袭能力。

先前的研究表明，TMPRSS4过表达与III期胃癌患者术后接受S-1辅助化疗的不良预后相关，而通过小干扰RNA（siRNA）沉默TMPRSS4可提高胃癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗的敏感性。在一项多中心回顾性研究中，研究人员还发现5-FU化疗敏感性与TMPRSS4表达在胃癌中存在关联。

RNA干扰技术通过siRNA沉默特定基因表达，在治疗各种疾病包括癌症方面具有巨大潜力。然而，裸露形式的siRNA临床应用受到血液中酶降解和靶细胞摄取差的限制。为克服这些问题，各种纳米载体被开发用于高效递送siRNA。其中，脂质纳米颗粒（LNP）是最先进的递送系统之一，具有良好的相容性、低毒性以及高效封装siRNA的能力。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员开发了一种新的抗TMPRSS4 siRNA治疗策略，通过设计脂质纳米颗粒，评估了抗TMPRSS4-siRNA负载LNPs在胃癌小鼠模型中的生物分布、抗肿瘤效果和安全性。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过微流控系统制备包裹TMPRSS4-siRNA的LNP，并表征其粒径和包封效率；利用人胃癌NUGC-3细胞系进行体外细胞摄取和细胞内分布研究；建立裸鼠NUGC-3细胞皮下异种移植瘤模型，通过活体成像系统分析LNP的生物分布；设计两种给药方案（低剂量10μg siRNA/只和高剂量120μg siRNA/只）评估LNP-siTMPRSS4联合5-FU的抗肿瘤效果；通过蛋白质印迹法分析TMPRSS4、E-钙黏蛋白和磷酸化p44/42MAPK蛋白表达。

沉默TMPRSS4抑制体外ERK1/2信号

蛋白质印迹分析显示，Lipofectamine-siTMPRSS4显著降低了NUGC-3细胞中TMPRSS4蛋白表达。研究发现TMPRSS4沉默显著抑制了NUGC-3细胞中44/42MAP激酶的磷酸化，与对照siRNA转染的细胞相比有统计学差异（p=0.03）。这表明TMPRSS4沉默可能通过抑制ERK信号通路发挥抗肿瘤作用。

LNP-siTMPRSS4的特性、体外细胞摄取和细胞内分布

制备的LNP直径约为100纳米（粒径范围53.4纳米至231纳米），包封效率达93%。在NUGC-3细胞中，LNP摄取在暴露3小时后即可在细胞质中观察到。处理后3小时，观察到LNP在溶酶体上的强烈共定位（红色和绿色标记在合并图像中产生黄色荧光），而裸露siRNA在溶酶体上的共定位很少。这些结果表明siRNA-LNP被胃癌细胞有效摄取。

体内LNP-siTMPRSS4的生物分布

在NUGC-3肿瘤小鼠中研究了包裹Cy.5标记siRNA的LNP的体内分布，并与裸露Cy.5标记siRNA进行比较。虽然大多数裸露siRNA在肾脏中积累，但大多数LNP在肝脏中积累。LNP在肝脏、肾脏、脾脏和肿瘤中的积累显著高于裸露siRNA。在接受LNP的小鼠中，肿瘤显示的荧光信号密度与脾脏大致相同。

LNP-siTMPRSS4联合5-FU抑制体内胃癌细胞生长

研究人员评估了LNP-siTMPRSS4联合5-FU在植入NUGC-3细胞的异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果。方案1使用低剂量LNP评估联合治疗的抗肿瘤效果，结果显示LNP-TMPRSS4联合5-FU治疗组的肿瘤生长小于LNP-siCONT联合5-FU组，但四组（PBS、5-FU、5-FU加对照LNP、5-FU加抗TMPRSS4 siRNA-LNP）之间的肿瘤体积和重量无显著差异。因此，方案2使用高剂量LNP-siTMPRSS4评估联合治疗的抗肿瘤效果，结果显示高剂量LNP-siTMPRSS4联合治疗导致肿瘤重量（对照：962.6±435.5毫克 vs LNP-siTMPRSS4：487.4±331.7毫克）和体积（对照：2.70±1.36立方厘米 vs LNP-siTMPRSS4：1.34±0.80立方厘米）显著减少，但与5-FU单药治疗相比，基于最大肿瘤直径的大小无显著差异。蛋白质印迹分析显示，与5-FU单药治疗相比，LNP-siTMPRSS4联合5-FU显著降低了肿瘤中TMPRSS4的表达，并显著增加了肿瘤中E-钙黏蛋白的表达。

体内LNP毒性

研究人员研究了LNP复合物的体内毒性。在用LNP和5-FU联合治疗的小鼠中未观察到体重的显著变化（开始：19.5±1.3克，结束：22.1±1.4克）。主要器官（包括肝脏、脾脏和肺）的苏木精和伊红染色也未显示明显的组织学变化。用LNP治疗的小鼠血清丙氨酸氨基转移酶和肌酐水平在正常范围内。

研究结论和讨论部分强调了这项研究的重要意义。在III期胃癌中，多西他赛和S-1的附加治疗改善了患者术后预后，但仍有进一步改进的空间。本研究证明，靶向TMPRSS4使用LNP联合5-FU的治疗策略在胃癌小鼠模型中显示出显著抗肿瘤效果。

当LNP进入细胞后，siRNA的内体逃逸对于细胞质中的转录后基因沉默至关重要。研究表明，大多数LNP在转染后3小时驻留在内体中，但蛋白质印迹显示添加LNP后TMPRSS4表达显著下调，这表明Cy.5-siRNA有效地从内体储库逃逸并进入细胞质。

在剂量方面，研究发现10微克siRNA/只小鼠的剂量不足以产生抗肿瘤效果，而约120微克siRNA/只小鼠（相当于6毫克siRNA/千克小鼠体重）的高剂量能够达到治疗效果。这提示优化siRNA剂量是未来的挑战。研究还发现，尽管没有靶向配体，肿瘤中的荧光信号高于先前报道，这表明增强LNP在肿瘤中的积累可能需要活性靶向配体来减少siRNA剂量。

关于作用机制，TMPRSS4沉默通过siRNA诱导体内抗肿瘤效果。TMPRSS4靶向使用siRNA显著上调体内E-钙黏蛋白表达，并抑制体外44/42MAPK磷酸化。这表明TMPRSS4下调与EMT和ERK信号失活相关，尽管研究结果未提供直接证据证明TMPRSS4抑制通过EMT和ERK信号失活诱导抗肿瘤效果。

在安全性方面，研究评估了si-TMPRSS4-LNP的体内毒性。在接受高剂量LNP的组中未观察到关于肝或肾功能的LNP副作用。在人类中，TMPRSS4 mRNA在食管、胃、小肠、结肠和肾脏中微弱检测到，但TMPRSS4的生理作用仍不清楚。TMPRSS4基因敲除小鼠可存活、可生育且无明显异常，提示TMPRSS4的功能冗余。这些数据表明，使用siRNA沉默TMPRSS4可能具有最小的副作用。

这项研究为胃癌治疗提供了新的思路，特别是针对TMPRSS4过表达导致的化疗耐药问题。通过开发高效的siRNA递送系统，研究人员成功实现了靶向基因治疗与常规化疗的协同作用，为临床转化奠定了基础。未来研究可进一步探索活性药物靶向的效果，以及TMPRSS4下调抗肿瘤作用的具体机制，为胃癌患者提供更有效的治疗选择。