提升PCR检测性能：长单核苷酸重复序列微卫星不稳定性分析系统在子宫内膜癌中的应用与评估

《Scientific Reports》：Improving the performance of polymerase chain reaction for microsatellite instability testing in endometrial cancer

【编辑推荐】子宫内膜癌（EC）中错配修复缺陷（dMMR）是免疫治疗的重要生物标志物，但现有检测方法存在差异。本研究针对Promega公司两种PCR检测方法（OncoMate? MSI Dx分析系统与长单核苷酸重复序列LMR MSI分析系统）在126例子宫内膜癌样本中进行头对头比较。结果显示，与免疫组化（IHC）相比，LMR系统具有更高的灵敏度（95.5% vs 86.5%）和特异性（68.1% vs 53.5%），尤其适用于检测子宫内膜癌中常见的微小微卫星位移。该研究为优化子宫内膜癌dMMR/MSI检测策略提供了重要依据。

　　

在妇科恶性肿瘤中，子宫内膜癌（Endometrial Cancer, EC）的发病率持续上升，其中约20%-30%的病例存在错配修复缺陷（Mismatch Repair Deficiency, dMMR）。这一分子特征不仅与林奇综合征（Lynch Syndrome）的遗传易感性相关，更是预测免疫检查点抑制剂疗效的关键生物标志物。目前，临床指南推荐通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白的表达缺失来判定dMMR状态。然而，作为一种功能学检测，微卫星不稳定性（Microsatellite Instability, MSI）的PCR（Polymerase Chain Reaction）分析能否与IHC结果高度一致，尤其在子宫内膜癌这种已知存在“轻微不稳定性”模式的肿瘤中，仍存在争议。由于多数MSI检测方法最初基于结直肠癌（Colorectal Carcinoma, CRC）优化，其在子宫内膜癌中的敏感性可能不足，导致部分dMMR肿瘤被误判为微卫星稳定（Microsatellite Stability, MSS），从而可能影响患者的治疗决策。

为此，由Marta Mendiola和Victoria Heredia-Soto作为共同第一作者的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究，旨在系统比较Promega公司两款商业化PCR检测试剂盒——已获CE-IVD认证的OncoMate? MSI Dx分析系统与新型长单核苷酸重复序列（Long Mononucleotide Repeat, LMR）MSI分析系统——在子宫内膜癌样本中的性能。研究选取了126例既往经IHC明确MMR状态的早期子宫内膜癌样本（其中67例为dMMR，59例为pMMR），并同时获取了MMR相关基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的基因组改变数据作为正交验证。结果显示，LMR系统与IHC的总体符合率（78.8%）显著高于OncoMate系统（64.8%），其敏感性和特异性也均更优。这表明，包含更长重复序列位点的LMR面板能更有效地捕获子宫内膜癌中典型的微小微卫星位移，有效降低了假阴性风险。该研究为子宫内膜癌的精准分子分层及免疫治疗候选者的筛选提供了更优的检测方案。

关键技术与方法概述

本研究基于拉巴斯大学医院（La Paz University Hospital）的早期子宫内膜癌队列（n=126）。关键技术包括：通过组织芯片进行MMR蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的免疫组化（IHC）分析；使用MS-MLPA（Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）试剂盒检测MLH1启动子甲基化状态，并利用定制Panel进行MMR基因二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS），以综合判定MMR基因组状态；分别采用Promega公司的OncoMate MSI Dx分析系统（包含5个短单核苷酸重复标记物和2个五核苷酸标记物）和LMR MSI分析系统（包含4个短单核苷酸重复标记物和4个长单核苷酸重复标记物）进行微卫星不稳定性（MSI）的PCR-毛细管电泳分析。统计学分析采用Fisher精确检验和逻辑回归模型评估各检测方法的一致性、敏感性和特异性。

研究结果

描述性结果

样本经IHC判定为dMMR（53.2%）和pMMR（46.8%）。MMR基因组状态分析显示，55例（43.7%）存在MMR基因改变。OncoMate和LMR MSI检测的无效病例数分别为18例（14.3%）和13例（10.3%）。在可评估病例中，OncoMate鉴定出37例（29.4%）MSI，而LMR系统鉴定出44例（34.9%）MSI，两者差异显著（p = 6.5e-04）。在单个标记物不稳定性分析中，OncoMate面板中的BAT-26和MONO-27最常出现异常，而LMR面板中的BAT-52和BAT-59不稳定性比例最高。

OncoMate与长单核苷酸重复测试的评分

根据IHC和MMR基因状态分类的样本中不稳定标记物数量的直方图显示，将≥2个不稳定的微卫星标记物作为MSI的判定标准是合理的，这与制造商推荐和常规实践一致。

OncoMate与长单核苷酸重复测试的比较

两种PCR技术的MSI状态判定存在显著相关性（p = 2.2e-16），总体一致率为91.2%。但在dMMR病例中，OncoMate将9例判定为MSS，而LMR系统则将这些病例正确归类为MSI，提示LMR对dMMR的检出能力更强。

聚合酶链反应测试与免疫组织化学的比较

以IHC为参考标准，LMR系统与IHC结果的一致性（78.8%）和相关性（62.6%）均显著高于OncoMate系统（分别为64.8%和38.8%）。Fisher精确检验表明两种PCR技术与IHC结果均存在显著依赖性（OncoMate: p = 2.96e-07; LMR: p = 4.89e-12）。不一致病例主要出现在IHC判定为dMMR而PCR判定为MSS的病例中。进一步分析发现，LMR系统在MLH1/PMS2蛋白缺失的病例中表现出更高的相关性。

聚合酶链反应测试与错配修复基因组状态的比较

以MMR基因组状态为参考，LMR系统的总体符合率（80.2%）和相关性（60.5%）也高于OncoMate系统（分别为75.9%和54.0%）。Fisher精确检验再次证实两种PCR技术与MMR基因组状态显著相关（OncoMate: p = 1.82e-09; LMR: p = 2.27e-12）。

总体一致性比较

综合性能评估显示，以IHC为参考时，LMR系统的敏感性（95.5%）和特异性（68.1%）均高于OncoMate系统（敏感性86.5%，特异性53.5%）。以MMR基因组状态为参考时，LMR系统同样表现出更高的特异性（77.6% vs 70.4%）和总体正确分类比例（80.2% vs 75.9%）。

不一致病例总结

对不一致病例的深入分析表明，LMR系统的结果与MMR基因组状态的一致性更高，尤其是在dMMR discrepant cases中，这进一步支持了LMR系统在子宫内膜癌MSI检测中的可靠性。

结论与讨论

本研究表明，在早期子宫内膜癌中，Promega公司的LMR MSI分析系统在检测微卫星不稳定性方面性能优于其OncoMate? MSI Dx分析系统。LMR系统与当前金标准IHC以及MMR基因组状态具有更高的一致性、敏感性和特异性。这种性能提升可能归因于LMR面板中包含的更长的单核苷酸重复序列（52-60个重复单元），这些位点对DNA错配修复功能缺陷更为敏感，能够更有效地检测出子宫内膜癌中常见的、幅度较小的微卫星位移（minimal shifts），从而减少假阴性结果。

研究结果强调了肿瘤类型对MSI检测性能的重要影响。由于子宫内膜癌的MSI模式可能不同于结直肠癌，直接套用为结直肠癌优化的检测面板（如主要包含短重复序列的OncoMate）可能导致灵敏度下降。因此，对于子宫内膜癌的dMMR/MSI检测，采用包含长重复序列的优化面板（如LMR系统）是更可靠的选择。

该研究的发现具有重要的临床意义。dMMR/MSI状态是子宫内膜癌分子分型、林奇综合征筛查和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1抗体）疗效预测的关键生物标志物。检测方法的准确性直接关系到患者的治疗决策和预后。本研究为临床实验室选择最适合子宫内膜癌的MSI检测方法提供了直接证据，有助于实现更精准的患者分层。然而，研究也指出，dMMR表型与MSI基因状态并非完全等同，不同检测方法间的差异可能会影响免疫治疗疗效的预测。因此，未来仍需进一步研究以确定作为免疫治疗反应预测生物标志物的最佳dMMR/MSI检测方法。