家族队列揭示孤独症谱系障碍患儿肠道菌群特征：双歧杆菌减少与生物膜形成通路富集

《Scientific Reports》：Gut microbiota analysis in children with autism spectrum disorder and their family members

为解决既往孤独症谱系障碍（ASD）肠道菌群研究受遗传和家庭环境混杂因素影响的问题，研究人员开展了一项基于家庭队列的宏基因组学研究。该研究通过比较ASD患儿、其非ASD同胞及父母的肠道菌群，发现ASD患儿存在独特的菌群失调特征，表现为双歧杆菌（Bifidobacterium）等有益菌减少，而拟杆菌（Bacteroides）和梭菌（Clostridium）富集，且生物膜形成通路显著上调。该研究为ASD的病理机制提供了新的功能视角，并提示肠道菌群干预或成为ASD治疗的新靶点。

　　

孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种神经发育障碍，主要表现为社交互动障碍、沟通困难以及重复刻板的行为和兴趣。近年来，ASD的全球患病率持续攀升，已成为一个重大的公共卫生问题。尽管遗传因素在ASD发病中扮演着重要角色，但越来越多的证据表明，肠道菌群（Gut Microbiota）的失调可能通过“肠-脑轴”（Gut-Brain Axis）影响大脑发育和行为，从而参与ASD的发病机制。

然而，该领域的研究面临着诸多挑战。许多研究在比较ASD患儿与健康对照时，未能有效控制遗传背景、家庭环境、饮食习惯等混杂因素，导致研究结果存在不一致性。例如，关于ASD患儿肠道菌群多样性（Alpha Diversity）的变化，不同研究得出了截然相反的结论：有的报告多样性降低，有的则报告无显著差异，甚至还有研究发现多样性升高。这些矛盾的结果使得肠道菌群与ASD之间的因果关系变得扑朔迷离。

为了更清晰地揭示ASD相关的肠道菌群特征，并排除遗传和家庭环境的干扰，来自厦门大学附属第一医院临床医学研究院等机构的研究团队设计了一项独特的家庭队列研究。该研究招募了19名ASD患儿、8名非ASD同胞以及36名父母，共计63名参与者。通过宏基因组测序技术，研究人员系统性地比较了这四组人群（ASD患儿、同胞、父亲、母亲）的肠道菌群结构、物种组成和功能潜力。该研究旨在回答一个核心问题：在共享遗传背景和家庭环境的前提下，ASD患儿是否依然存在独特的肠道菌群特征？这些特征又揭示了哪些潜在的病理机制？

为了回答上述问题，研究人员开展了一项基于家庭队列的横断面研究。该研究招募了来自17个家庭的63名参与者，包括19名ASD患儿、8名非ASD同胞以及36名父母。所有参与者在样本采集前均遵循统一的饮食指南，并排除了近期使用抗生素、益生菌等可能影响菌群的因素。研究人员收集了所有参与者的粪便样本，并利用Illumina平台进行宏基因组测序。通过对测序数据进行质量控制、去宿主污染、从头组装和基因预测，构建了非冗余基因集。随后，利用MetaPhlAn2、HUMAnN2等工具对物种组成和功能通路（如KEGG、COG、CAZy等）进行注释和定量分析。在统计分析方面，研究采用了PERMANOVA、Wilcoxon检验、LEfSe分析以及MaAsLin多变量关联模型等方法，以揭示组间差异并控制年龄、性别等混杂因素的影响。

研究结果

1. 组间微生物组成差异

研究首先通过堆叠柱状图直观展示了四组人群在门水平和属水平的菌群组成。结果显示，菌群组成在不同组间存在明显差异。在门水平上，放线菌门（Actinobacteria）表现出明显的年龄相关模式，其在儿童组（ASD患儿和同胞）中的相对丰度远高于成人组（父母）。在属水平上，双歧杆菌属（Bifidobacterium）也呈现出强烈的年龄效应，在儿童中高度富集，而在成人中几乎缺失。值得注意的是，在儿童内部比较时，ASD患儿中双歧杆菌的相对丰度似乎低于其非ASD同胞。此外，普雷沃菌属（Prevotella）在成人组中的丰度普遍高于儿童组。这些结果表明，虽然年龄是塑造人类肠道菌群的主要驱动因素，但ASD患儿在共享的家庭环境和遗传背景下，依然表现出特定的肠道菌群失调，其特征是双歧杆菌等关键有益菌的减少。

2. 特定类群丰度变化

进一步对特定类群的分析发现，放线菌门（Actinobacteria）在四组间存在显著差异。一个清晰的年龄相关模式被观察到，两个儿童队列（ASD和同胞）的放线菌门比例均高于成人父母队列，且变异性更大。更重要的是，ASD组中放线菌门的丰度显著低于其同胞组，这表明ASD患儿的肠道菌群结构发生了改变。此外，研究还观察到黄杆菌纲（Flavobacteriia）在组间存在显著差异。最引人注目的发现是，黄杆菌纲在ASD组中几乎完全缺失，而在非ASD同胞、母亲和父亲组中均有存在。由于家庭成员共享一致的饮食，这一发现提示，非饮食因素（如宿主遗传或特定的环境暴露）可能在调节黄杆菌纲水平中扮演了更主导的角色。

3. Alpha多样性分析

Alpha多样性分析用于评估样本内的物种多样性。研究采用香农指数（Shannon Index）和Chao1指数进行评估。结果显示，母亲组（HC-m）的物种多样性中位数最高，ASD组紧随其后。母亲组和ASD组的多样性均显著高于父亲组（HC-f）和非ASD同胞组（HC-c）。在物种丰富度（Chao1指数）方面也观察到了类似的模式，母亲组再次显示出最高的中位数丰富度。ASD组的多样性与母亲组相当，且均显著高于父亲组和同胞组。这一发现与许多报道ASD患儿肠道菌群多样性降低的文献形成了鲜明对比。研究结果表明，ASD患儿的肠道菌群并未表现出多样性缺陷，反而呈现出一种令人惊讶的、与母亲菌群相当的、具有高物种丰富度和多样性的稳健群落。

4. Beta多样性分析

Beta多样性分析用于评估样本间的群落结构差异。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）结果显示，不同组间的肠道菌群群落结构存在显著差异。ASD组的样本点与非ASD同胞组、父亲组和母亲组的样本点明显分离，形成了独立的簇。非ASD同胞组的样本点聚集紧密，而ASD组的样本点则更为分散。父亲组和母亲组的样本点相对分散，且与儿童组样本的距离较大。PERMANOVA分析结果证实，分组因素对微生物群落结构有显著影响，解释了14.1%的样本间变异。这些结果表明，ASD患儿的肠道菌群在整体结构上与非ASD家庭成员存在显著差异。

5. 关键物种差异分析

研究进一步分析了导致组间菌群差异的主要物种。结果显示，拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和梭菌属（Clostridium）的物种是造成差异的最主要贡献者。与同胞组相比，ASD组中多种拟杆菌物种（如Bacteroides fragilis, Bacteroides massiliensis, Bacteroides nordii）的丰度更高。与此形成鲜明对比的是，具有益生作用的双歧杆菌属在非ASD同胞组中最为普遍。研究发现，ASD患儿中Bifidobacterium breve和Bifidobacterium longum等有益物种的丰度显著降低。梭菌属的模式则更为复杂。虽然Clostridium symbiosum和Clostridium citroniae等物种在ASD组中丰度升高，但Clostridium bartlettii的丰度却低于同胞组。这突显了梭菌在肠道生态系统中的物种特异性作用。

6. LEfSe分析

LEfSe分析用于识别组间具有显著差异的生物标志物。结果显示，黄杆菌纲（Flavobacteria）的相关类群是非ASD同胞组最显著的特征。相反，梭菌纲（Clostridia）的多个类群在ASD组中富集。进一步分析发现，直肠真杆菌（Eubacterium rectale）是ASD组的首要生物标志物，其LDA效应值最高。这一发现与一些先前报道ASD个体中直肠真杆菌减少的研究相矛盾，突显了ASD中菌群改变的复杂性。

7. 通路富集分析

研究通过KEGG通路富集分析，揭示了组间功能通路的差异。结果显示，ASD组中“大肠杆菌生物膜形成”（Biofilm formation-Escherichia coli）和“ABC转运蛋白”（ABC transporters）等通路的基因丰度显著上调。而“甲烷代谢”（Methane metabolism）、“酵母减数分裂”（Meiosis-yeast）、“酵母线粒体自噬”（Mitophagy-yeast）以及“各种类型N-聚糖生物合成”（Various types of N-Glycan biosynthesis）等通路的基因丰度则显著下调。生物膜形成通路的富集提示，ASD患儿肠道中的机会性病原体可能通过增强其生物膜形成能力，在肠壁上建立持久的“微生态病灶”，从而影响肠道屏障功能和免疫反应。

8. 代谢物关联分析

研究还对代谢物进行了分析。结果显示，ASD组中三甲胺（Trimethylamine, TMA）和氨（NH₃）的相对丰度较高。三甲胺水平的升高可能表明ASD患儿肠道微生物活性或营养代谢发生了改变。氨水平的升高则可能表明蛋白质或氮代谢受到干扰，而氨作为一种神经毒性物质，其积累可能与ASD的病理生理学有关。此外，代谢物L-丙氨酸（L-alanine）和L-谷氨酰胺（L-glutamine）在ASD组中的相对丰度也显著增加。L-谷氨酰胺是大脑中兴奋性神经递质谷氨酸的前体，其丰度的增加与ASD中常见的神经元信号传导和兴奋-抑制失衡有关。

研究结论与讨论

本研究通过一个独特的家庭队列设计，系统性地揭示了ASD患儿肠道菌群在整体结构、物种组成和功能潜力上的显著特征。核心发现证实，ASD患儿的肠道菌群存在独特的失调模式，其特征是“有益菌减少和潜在机会性病原体增加”。具体表现为双歧杆菌属（Bifidobacterium）等有益菌的显著减少，以及拟杆菌属（Bacteroides）和梭菌属（Clostridium）的富集。

然而，本研究最引人注目的发现是，ASD患儿的肠道菌群Alpha多样性（包括香农指数和Chao1指数）不仅没有降低，反而显著高于其非ASD同胞，甚至与母亲组的多样性水平相当。这一“反常”现象挑战了该领域关于ASD菌群多样性降低的单一叙事。研究人员提出，ASD患儿肠道中的“高多样性”可能并不等同于“健康”，而是一种由不稳定的群落结构和机会性病原体过度生长驱动的“病理性高多样性”或“伪多样性”。在这种状态下，核心功能类群（如双歧杆菌）的稳定性可能被破坏，从而为有害代谢物的产生创造了环境。

在功能层面，研究首次发现ASD患儿肠道菌群中“大肠杆菌生物膜形成”通路显著上调。基于此，研究提出了一个全新的“生物膜假说”：ASD患儿肠道中的某些机会性病原体（如致病性大肠杆菌）可能通过增强其生物膜形成能力，在肠壁上建立持久的“微生态病灶”。这些病灶不仅可能作为慢性、低度炎症的持续触发因素，还可能改变肠道屏障的通透性，导致“肠漏”，使得细菌产物（如LPS）和有害代谢物进入血液，最终通过“肠-脑轴”影响神经发育和功能。这为理解ASD相关的免疫异常以及为何某些儿童对益生菌等干预措施反应不佳提供了新的理论框架。

此外，ABC转运蛋白通路的富集也为理解ASD的代谢异常提供了线索。该通路的变化表明，ASD患儿的肠道菌群在处理和转运小分子方面具有独特的能力，这可能部分解释了ASD儿童为何常出现某些食物成分吸收不良、饮食偏好独特或对环境化学物质敏感性增加等代谢异常。

综上所述，本研究不仅通过家庭对照设计为ASD肠道菌群失调提供了强有力的证据，更重要的是，它通过引入“病理性高多样性”的概念和“生物膜假说”，将研究视角从“菌群-疾病关联”推进到了“菌群-功能-疾病机制”的探索，为未来开发针对性的微生物干预疗法（如靶向生物膜的药物或益生菌）奠定了理论基础。