原薯蓣苷通过调控细胞周期与TGF-β/p-Smad2-4通路增强甲氨蝶呤诱导的HepG2肝癌细胞球衰老及衰老清除活性

《Scientific Reports》：Protodioscin enhances Methotrexate-induced senescence and senolytic activity in HepG2 liver cancer spheroids by modulating cell cycle regulators and the TGF-β/p-Smad2-4 signaling pathway

本研究针对肝癌治疗中化疗诱导的细胞衰老可能导致肿瘤复发和耐药的问题，探讨了天然化合物原薯蓣苷(PD)作为衰老清除剂在甲氨蝶呤(MTX)处理的3D HepG2细胞球模型中的协同作用。研究发现PD可剂量依赖性地增强MTX诱导的细胞衰老和凋亡，同时下调TGF-β/p-Smad2-4信号通路，为肝癌联合治疗提供了新策略。

　　

在肝癌治疗领域，一个令人困扰的悖论日益凸显：化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，会诱导部分细胞进入"衰老"状态。这些衰老细胞虽然停止分裂，却依然活跃地分泌多种炎症因子和生长因子，形成所谓的衰老相关分泌表型(SASP)，反而为肿瘤的复发和转移创造了温床。肝细胞癌(HCC)作为最常见的原发性肝癌类型，其全球发病率的持续上升使得破解这一悖论显得尤为紧迫。甲氨蝶呤(MTX)作为传统的抗代谢类药物，虽能通过诱导细胞衰老抑制肿瘤生长，但随之而来的衰老细胞累积却可能成为治疗失败的隐患。

正是在这样的背景下，来自克尔曼沙汗医科大学的研究团队将目光投向了天然植物化合物原薯蓣苷(PD)。这种从蒺藜、天门冬等植物中提取的甾体皂苷，近年来因显示出广泛的抗炎、抗癌活性而备受关注。研究人员在《Scientific Reports》上发表的最新研究中，创新性地探索了PD是否能够作为"衰老清除剂"，特异性地清除由MTX诱导的衰老肝癌细胞，从而提升化疗效果。

为了模拟更接近人体肿瘤的微环境，研究团队采用了三维(3D)细胞球培养技术。他们通过悬滴法成功构建了HepG2肝癌细胞球，并利用人包皮成纤维细胞(HFF1)的条件培养基优化培养体系，最终获得了直径150-200微米、结构紧密的细胞球模型。这种3D模型相比传统二维培养，能更好地再现肿瘤细胞的生理状态和细胞间相互作用。

研究的关键发现令人振奋：当PD与MTX联用时，不仅显著增强了后者的抗癌效果，还展现出剂量依赖性的双重作用规律。在分子机制层面，研究人员通过Western blot、ELISA、流式细胞术等一系列实验技术，揭示了PD通过调控细胞周期关键蛋白(p16、p21、p27、p53)和TGF-β/p-Smad2-4信号通路，协同促进衰老细胞清除的精细机制。

主要实验方法概述

研究采用悬滴法在PolyHEMA包被的96孔板中培养HepG2细胞球，使用1:1混合的DMEM-HG培养基和HFF1条件培养基。通过MTT法测定PD和MTX的IC₅₀值，选取亚毒性浓度进行联合处理。利用β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色评估衰老水平，Annexin V/PI双染和Calcein-AM/PI染色分别检测凋亡和细胞死亡，ELISA检测TGF-β水平，Western blot分析细胞周期和TGF-β通路相关蛋白表达。

HepG2来源细胞球的特征

研究成功建立了直径约150-200微米的HepG2细胞球模型。培养第2天细胞开始聚集，第5天形成致密结构，第7天达到成熟稳定状态，呈现出边缘光滑、结构紧密的典型球体形态，为后续药物评价提供了理想的实验平台。

PD和MTX对HepG2来源细胞球活力的影响

MTT实验显示，PD和MTX均能剂量依赖性地抑制细胞球活力，24小时IC₅₀值分别为16.28μM和12.25μM。这一结果为后续选择亚毒性浓度(PD:1.6、4、8.14μM；MTX:6μM)进行联合处理提供了依据。

PD和MTX对HepG2来源细胞球氧化应激标志物的影响

在氧化应激指标检测中，MTX单独处理显著提升了活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)水平。当与PD联用时，低浓度PD(1.6μM和4μM)进一步加剧了氧化应激，而高浓度PD(8.14μM)则表现出抗氧化效应，这种剂量依赖性的双相调节作用提示PD在不同浓度下可能通过不同机制影响细胞氧化平衡。

PD和MTX对TGF-β水平的影响

ELISA检测显示，MTX处理已显著降低TGF-β水平，而PD与MTX联用后，中、高浓度组(4μM和8.14μM)TGF-β水平进一步下降。TGF-β作为重要的衰老相关分泌因子，其下调表明PD可能通过调节肿瘤微环境来增强senolytic效果。

PD和MTX对SA-β-Gal活性的影响

衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色结果表明，MTX成功诱导了细胞衰老。更重要的是，中、高浓度PD与MTX联用后，SA-β-Gal活性显著增强，证实PD能够强化MTX诱导的衰老进程，这为理解PD的senolytic作用机制提供了重要线索。

PD和MTX对HepG2来源细胞球凋亡的影响

Annexin V/PI双染实验揭示，PD与MTX联用可显著提升细胞凋亡率，且呈现剂量依赖性增强效应。其中高浓度PD(8.14μM)联合组效果最为显著，表明PD不仅能增强衰老诱导，还能促进衰老细胞的最终清除。

PD和MTX对HepG2来源细胞球存活率的影响

Calcein-AM/PI活死细胞染色结果与凋亡检测一致：PD以浓度依赖方式增强MTX的细胞毒性作用。活细胞(绿色荧光)减少和死细胞(红色荧光)增加的明显剂量梯度，直观展示了PD作为化疗增敏剂的潜力。

PD和MTX对细胞周期和衰老相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，PD与MTX联用可进一步上调p16、p21、p27和p53等细胞周期调控蛋白的表达。特别值得注意的是，p53在MTX单独处理时变化不显著，而在PD加入后明显上调，提示PD可能通过激活p53通路增强衰老信号。这些蛋白的协同上调为PD促进细胞周期停滞提供了分子证据。

PD和MTX对TGF-β通路相关蛋白表达的影响

在TGF-β信号通路关键蛋白检测中，联合处理显著降低了p-Smad2和p-Smad4的磷酸化水平。这一发现与TGF-β含量的下降相呼应，表明PD可能通过抑制TGF-β/Smad信号转导来干扰衰老细胞的生存信号，从而促进其清除。

这项研究的结论部分描绘了一个清晰的作用图谱：PD通过多靶点调控增强MTX的抗肝癌效果。在机制层面，PD不仅强化了MTX诱导的细胞周期停滞(通过p16/p21/p27/p53通路)，还通过调节TGF-β/p-Smad2-4信号轴影响肿瘤微环境。特别有趣的是，PD展现出浓度依赖的双重角色——低浓度时主要增强氧化应激和衰老诱导，高浓度时则表现出抗氧化效应并更强力地促进凋亡。

这种双相效应提示我们在开发senolytic疗法时需要精细把握剂量窗口。研究还发现，尽管TGF-β信号被抑制，但p16、p21等细胞周期抑制蛋白反而上调，这表明可能存在TGF-β非依赖的调控通路，如ROS-p38MAPK等，这些发现为深入探索PD的作用机制指明了新方向。

从转化医学视角看，这项研究的意义不仅在于发现了一个潜在的天然senolytic候选物，更在于建立了3D细胞球模型在衰老研究中的应用价值。这种模型能更好地模拟体内肿瘤微环境，为研究细胞间相互作用和药物渗透提供了更可靠的平台。此外，研究揭示的PD剂量依赖性效应警示我们，天然产物的应用需要严格的浓度优化，以避免可能存在的双向调节效应。

尽管这项研究为肝癌治疗提供了新思路，但作者也指出其局限性：目前结果仅限于体外实验，PD在动物模型中的senolytic效果及潜在毒性仍需验证；TGF-β信号下游的具体效应分子及其与衰老-凋亡转换的关系有待深入解析；SASP因子谱的变化需要更全面的评估。

展望未来，研究人员建议进一步探索PD在体内模型中的疗效，优化PD与MTX的给药方案，并系统评估其对其他SASP因子的影响。同时，探讨PD是否能够增强其他化疗药物的senolytic效果，也将拓展其临床应用前景。

总之，这项研究首次揭示了PD作为天然senolytic剂在肝癌治疗中的潜力，阐明了其通过多通路协同增强MTX效果的分子机制，为开发基于衰老清除策略的肝癌联合治疗方案提供了重要的实验依据。随着人口老龄化加剧和肝癌发病率持续上升，这种针对化疗耐药性根源的创新策略，有望为改善肝癌患者预后开辟新的途径。