靶向长读长纳米孔测序：一种检测STRC变异和区分STRCP1假基因的补充方法

《Scientific Reports》：Targeted long-read nanopore sequencing as a complementary approach for detecting STRC variants and distinguishing the STRCP1 pseudogene

本研究针对常规短读长测序难以区分高度同源基因STRC及其假基因STRCP1的难题，采用纳米孔MinION平台结合长片段PCR富集，对149例携带STRC单等位基因缺失的听力损失患者进行靶向长读长测序。研究成功鉴定出27个变异（含14个新变异），确诊了22例STRC相关听力损失患者，诊断率达14.8%，证明该技术可有效提升复杂基因组区域致病变异的检出率。

　　

在遗传性听力损失的研究领域，立体纤毛蛋白（STRC）基因是导致轻度至中度感音神经性耳聋（SNHL）的重要病因。然而，对该基因进行精准的分子诊断一直充满挑战。这主要源于其所在的染色体15q15.3区域存在一个高度同源（达98%）的假基因STRCP1。传统的短读长二代测序（NGS）技术由于读长有限，难以将测序读数准确比对到STRC或其假基因上，导致序列组装错误，从而产生假阳性或假阴性变异调用结果，使得大量潜在的致病性单核苷酸变异（SNV）或小的插入缺失（indel）被遗漏。因此，开发能够有效区分STRC与STRCP1的检测方法，对于提升遗传性听力损失的诊断率至关重要。

为了突破这一技术瓶颈，研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果。他们创新性地采用牛津纳米孔技术（ONT）的MinION平台，结合长片段聚合酶链式反应（PCR）富集策略，对STRC基因区域进行靶向长读长测序。这种方法能够产生跨越整个STRC基因区域（约20 kb）的超长读长，从而清晰地将读数定位到正确的基因位点，有效规避了假基因的干扰。

本研究的关键技术方法主要包括：从超过10,000名日本听力损失患者建立的内部分子诊断队列中，筛选出149例经短读长NGS检测仅发现STRC杂合缺失（单拷贝丢失）且表型符合STRC相关听力损失（轻度至中度）的未确诊个体；利用特异性引物进行长片段PCR，扩增覆盖整个STRC基因的约20.3 kb的目标区域；使用纳米孔MinION平台对PCR产物进行长读长测序，并通过生物信息学流程进行比对和变异调用。

研究结果

携带STRC杂合缺失的个体数量

从经过63个耳聋基因panel短读长测序和拷贝数变异（CNV）分析后仍未能明确病因的6,151例患者中，根据遗传模式估计、听力损失程度（轻度至中度）以及存在STRC杂合缺失（单拷贝丢失）的筛选标准，最终确定了149名个体作为本研究的目标队列，进行后续的靶向长读长测序分析。

长片段PCR和MinION长读长测序

对所有149份样本的DNA进行长片段PCR富集均获得成功。测序数据的读长分布分析显示，平均读长为20.76 kb，与预期的PCR产物大小一致，表明MinION成功获得了覆盖整个STRC区域的单条长读长。比对结果可视化显示，单个读数即可覆盖完整的STRC区域，并且所有读数均来源于同一单倍型，这为STRC区域存在单拷贝丢失的基因组构成提供了证据。STRC区域（含内含子）的测序深度中位数为2,780X，而比对到STRCP1区域的深度中位数仅为5X，且STRC的碱基质量平均值（30.4）和比对质量平均值（55.1）均显著高于STRCP1（分别为23.6和18.0）。与此形成鲜明对比的是，短读长NGS数据中STRC和STRCP1的比对质量均较低且差异不显著。这表明长读长测序在STRC区域实现了更精确的比对和特异性。

检测到的SNV或小indel

在149名个体中，有43名（28.9%）携带SNV或小indel。共鉴定出27个不同的变异，其中13个是此前报道过的致病变异，14个是新发现的变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，这些变异中有8个被归类为致病性，1个为可能致病性，18个为临床意义未明（VUS）。仅考虑致病性或可能致病性变异，最终有22名个体被新诊断为STRC相关听力损失，诊断率为14.8%。研究还指出，有两个在ClinVar数据库中注册为致病性的变异（c.2303_2313+1del和c.5125A>G），因其在日本对照人群中出现频率较高，根据ACMG标准应被重新归类为良性或VUS。

病例展示

研究报道了一个具有启发性的家系案例。先证者（HL1432）为一名患有先天性中度SNHL的5岁女性，其双胞胎姐妹听力情况相似。其父亲自幼有轻度听力损失。之前的短读长NGS和CNV分析发现，先证者、其姐妹和父亲均携带STRC杂合缺失，听力正常的母亲也携带相同的杂合缺失。按照常理，若父母双方均携带杂合缺失，子代可能出现纯合缺失而导致听力损失。然而，先证者及其姐妹仅为杂合缺失。这一基因型不符的情况促使研究人员对该家系成员进行长读长测序，结果在先证者、其姐妹和父亲的另一个等位基因上发现了一个致病性变异（c.4549del），而母亲未携带此变异。因此，导致轻度至中度SNHL的基因型实为由母亲遗传的STRC杂合缺失与父亲遗传的致病性SNV构成的复合杂合状态。

讨论与结论

本研究证实，靶向长读长纳米孔测序是短读长NGS的有效辅助手段，能够精准解析如STRC这类因假基因存在而异常复杂的基因组区域。通过在149例既往未确诊的个体中进行检测，成功发现了27个变异，使22名患者获得了明确诊断，将日本人群STRC相关听力损失的预估患病率从之前的2.77%提升至2.99%。与以往需要结合SNP分型、Sanger测序等多种技术才能勉强检测STRC变异的方法相比，长读长测序凭借其超长读长的优势，能够一次性跨越同源区域，实现精准定位，显著提高了检测效率和准确性。尽管纳米孔测序本身存在较高的原始碱基错误率，但通过长片段PCR靶向富集和足够的测序深度，可以有效克服这一局限，获得可靠结果。

综上所述，将纳米孔长读长测序与长片段PCR富集相结合，为解决由高度同源序列（如基因与假基因）引起的遗传诊断难题提供了一种强大、经济且实用的解决方案。这项研究不仅提升了对STRC相关听力损失的病因认知和诊断能力，也为其他存在类似复杂性的遗传病基因的检测提供了可借鉴的技术路径。