植物ABCC2转运体的结构解析：毒性物质外排的分子机制

《Nature Communications》：Structural insights into toxicant export mediated by ABCC2 in Arabidopsis thaliana

本研究通过冷冻电镜技术解析了拟南芥毒性物质转运蛋白AtABCC2在三种不同状态下的高分辨率结构，揭示了其独特的二聚化界面和底物识别机制。该研究阐明了植物解毒过程中毒性物质跨膜转运的分子基础，为农业抗逆育种提供了重要理论依据。

　　

在自然界中，植物面临着各种环境污染物（如重金属、除草剂和杀虫剂）的威胁。这些毒性物质会严重影响植物的生长发育，甚至导致死亡。为了应对这些挑战，植物进化出了复杂的解毒机制，其中最关键的一步是将毒性物质或其共轭物隔离到液泡中，从而减少它们在细胞质中的毒性效应。在这一过程中，ABCC（ATP-binding cassette subfamily C）家族的转运蛋白发挥着至关重要的作用。

拟南芥ABCC2（AtABCC2）是植物解毒过程中的关键蛋白，位于液泡膜上，能够转运多种毒性物质，包括重金属-谷胱甘肽共轭物、除草剂和杀虫剂等。与AtABCC1相比，AtABCC2具有更广泛的底物特异性和更高的转运能力。然而，由于缺乏高分辨率的结构信息，科学家们对AtABCC2如何识别和转运底物的分子机制了解甚少。

为了解决这一科学问题，中国科学技术大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过冷冻电镜单颗粒分析技术，成功解析了AtABCC2在三种不同状态下的结构：无底物状态（apo state）、底物DNP-GS结合状态和ATP结合状态。这些结构为理解植物解毒的分子机制提供了重要见解。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用HEK293F细胞表达系统制备AtABCC2蛋白样品；通过尺寸排阻色谱和质谱光度法分析蛋白质的寡聚状态；使用冷冻电镜单颗粒分析技术解析高分辨率结构；采用ATP酶活性测定法评估蛋白质的转运功能；通过点突变实验验证关键功能位点。

ATP酶活性表征

研究人员首先对野生型AtABCC2（AtABCC2^WT）和催化突变体（AtABCC2^E1404Q）的ATP酶活性进行了系统表征。结果显示，AtABCC2^WT的ATP水解活性随ATP浓度增加而升高，K_m和V_max值分别为0.38±0.04 mM和2,547±73 nmol·min^-1·mg^-1。相比之下，E1404Q突变体的活性显著降低。在底物刺激实验中，DNP-GS、E₂17βG和PC₂能显著增强ATP酶活性，而GSSG、GSH和ABA-GE仅引起轻微变化。这些结果证实了AtABCC2对特定底物的高效转运能力。

野生型AtABCC2的apo状态整体结构

研究人员成功解析了AtABCC2^WT在apo状态下的结构，发现其同时存在单体（47%）和二聚体（26%）两种形式。单体结构分辨率为3.8 ?，二聚体为4.2 ?。AtABCC2包含典型的ABC转运蛋白结构域：TMD0、L0连接子、两个跨膜结构域（TMD1和TMD2）和两个核苷酸结合域（NBD1和NBD2）。与其他ABCC同源蛋白相比，AtABCC2的TMD0结构域位置独特，位于两个TMB之间而非侧面。功能实验表明，虽然TMD0缺失对活性影响不大，但同时缺失TMD0和L0连接子会显著降低ATP酶活性，说明L0连接子在转运过程中起关键作用。

二聚体界面分析显示，AtABCC2通过TMB2和NBD2形成二聚体界面，其中TM12和TM13主要负责介导相互作用。质谱光度法结果证实了单体（206 kDa）和二聚体（407 kDa）的存在，且两种形式的ATP酶活性无显著差异。

AtABCC2^EQ突变体的apo状态结构

AtABCC2^EQ突变体的二聚体结构解析达到3.5 ?分辨率。与野生型相比，突变体的二聚体比例更高，且二聚体界面存在明显构象变化。TM12和TM13发生约10°旋转，导致两个NBD2结构域更加靠近。在二聚体界面中还观察到磷脂分子，这些分子通过介导额外的相互作用稳定二聚体形式。结构比较发现，AtABCC2^EQ的TMB2和NBD2朝向TMB1移动，形成更紧凑的胞质面朝内空腔，可能代表转运循环中的中间状态。

AtABCC2^EQ的DNP-GS结合位点

DNP-GS结合状态的结构显示，底物分子结合在跨膜结构域形成的两亲性空腔内。结合界面包含带正电区域和疏水区域，关键残基R1198与DNP-GS的谷胱甘肽部分和硝基基团形成离子相互作用，而F1034、M1037和L1199等残基则与二硝基苯基部分发生疏水相互作用。点突变实验证实这些残基对底物识别至关重要，特别是R1198A突变体活性显著降低。与apo状态相比，DNP-GS结合引起TMB1向TMB2轻微移动，导致底物结合空腔部分闭合。

ATP结合引起的构象变化

ATP结合状态的结构显示，ATP分子结合在两个NBD结构域之间的裂隙中，触发NBD1和TMB1向对应结构域移动。这种构象变化通过连接螺旋传递到TMBs，导致底物结合空腔在胞质侧封闭。在此状态下，底物结合口袋在膜两侧均被阻塞，代表底物释放后的中间构象。比较apo和ATP结合状态发现，TM11发生显著构象变化，从长螺旋断裂为两个螺旋片段，这可能由P569和P574残基促成。

该研究通过系统性的结构生物学和生物化学分析，揭示了AtABCC2介导毒性物质转运的分子机制。研究不仅阐明了底物识别和转运的精确过程，还发现了植物ABCC转运蛋白独特的二聚化方式。这些发现不仅深化了对植物解毒机制的理解，也为开发新型农业抗逆策略提供了重要理论基础。通过调控AtABCC2的活性，未来可能培育出对环境污染具有更强耐受性的作物品种，这对保障粮食安全和生态环境保护具有重要意义。

特别值得注意的是，该研究首次揭示了植物ABCC转运蛋白中TMD0结构域的独特定位方式，以及脂质分子在二聚体形成中的调控作用。这些发现拓展了对ABC转运蛋白家族结构和功能多样性的认识，为比较生物学研究提供了重要参考。同时，研究建立的实验方法体系也为其他膜蛋白的结构与功能研究提供了宝贵经验。