小鼠海马转录组对重复应激的适应性 habitu 化：揭示早期cAMP信号与晚期糖皮质激素受体依赖的双重机制

《Nature Communications》：Distinct mechanisms of transcriptomic habituation to repeated stress in the mouse hippocampus

本研究针对慢性应激如何影响大脑对重复应激源的分子适应机制这一关键问题，通过多组学时间动态分析，揭示了小鼠海马转录组对束缚应激的 habitu 化涉及两种不同机制：早期由cAMP信号介导的快速钝化和晚期由糖皮质激素受体(GR)依赖的转录反应缩短。该研究为理解应激相关精神疾病的分子基础提供了重要资源。

　　

当生活压力接踵而至，我们的大脑如何学会“处变不惊”？这种对重复压力的适应能力——科学上称为“habituation”（ habitu 化）——是心理健康的关键决定因素。然而，当压力从急性变为慢性时，大脑内部的分子交响曲是如何随之调整的，至今仍是一个未解之谜。以往的研究大多关注慢性应激后大脑的长期改变，而对于应激反应本身如何随着重复暴露而动态演变，特别是在全基因组水平上，我们知之甚少。这个问题至关重要，因为适应不良是许多神经精神疾病，如抑郁症和焦虑症的核心风险因素。

为了回答这个问题，由Rebecca Waag、Lukas von Ziegler、Pierre-Luc Germain和Johannes Bohacek等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项开创性研究。他们利用先进的多组学技术，首次详细描绘了小鼠海马体对重复束缚应激的转录组和表观基因组适应蓝图，并揭示了背后两种截然不同的分子机制。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：他们建立了急性和慢性束缚应激的小鼠模型，通过批量RNA测序(RNA-seq)和ATAC-seq（测定转座酶可及染色质的高通量测序）动态监测了应激后多个时间点的全转录组和染色质可及性变化。此外，他们还采用了10x Genomics单核多组学测序技术（同时检测同一细胞核的RNA和染色质可及性），从而在单细胞分辨率下解析了不同细胞类型对应激的反应和 habitu 化现象。行为学测试（旷场实验）和血清皮质酮(CORT)水平的酶联免疫吸附测定(ELISA)被用来评估应激的生理和行为后果。数据分析方面，研究者开发了活动依赖性转录(ADT)评分来量化单个神经元的激活状态，并运用了多种生物信息学工具进行差异表达、基因集富集和motif可及性分析。

转录组动力学与全局 habitu 化

研究人员首先精确描绘了急性束缚应激(ARS)后小鼠腹侧海马(vHC)的转录组动态变化。他们发现基因表达在应激开始后45分钟发生强烈改变，并以波浪式演进，在数小时内恢复基线，24小时后已无差异表达基因。随后，他们探究了经过10天或20天慢性束缚应激(CRS)后，这种急性应激反应如何改变。结果令人惊讶：无论是10天还是20天的CRS，都导致了广泛而深刻的转录组 habitu 化——绝大多数应激反应基因的表达在CRS动物中被显著削弱。更重要的是，这种 habitu 化并非源于基线基因表达的永久性改变，因为CRS动物与对照组在静息状态下没有显著差异。这表明 habitu 化是一种反应性的钝化，而非基础状态的偏移。

habitu 化时间动力学揭示不同机制

通过精细的时间序列分析，研究者发现 habitu 化并非单一模式。他们将上调的应激反应基因分为三个具有不同 habitu 化动态的簇：簇1（早期钝化）的基因在应激后45分钟的表达即被削弱，这些基因富集于促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和食欲素受体信号通路，并富含cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)和血清反应因子(SRF)等转录因子的靶基因，其中包括著名的即刻早期基因(IEGs)如Fos。簇2（快速恢复）的基因在应激后1小时30分正常达到峰值，但在CRS动物中更快地返回基线，这些基因显著富集于对糖皮质激素的反应，其标志是糖皮质激素受体(GR)的靶基因，如Fkbp5。簇3（3小时表达缺失）的基因在CRS动物中于3小时时间点未能正常上调。通过将应激反应基因与地塞米松(DEX，一种GR激动剂)注射或体外 forskolin（激活cAMP通路）处理诱导的基因表达谱进行比较，研究团队证实了他们的推测：早期 habitu 化（簇1）与cAMP信号相关，而晚期的 habitu 化（簇2和3）则依赖于GR信号。这提示存在两种机制：快速的、GR非依赖的早期阻尼和慢速的、GR依赖的晚期阻尼。

行为与神经内分泌结果

行为学测试表明，经过10天或20天CRS的小鼠在旷场中表现出类似的行为变化，包括活动量增加和中心区域停留时间减少，提示焦虑样行为增加。在神经内分泌层面，尽管转录组表现出强烈的 habitu 化，但血液中的皮质酮(CORT)水平在经历了10天CRS的雄性小鼠中仅出现轻微钝化，而在雌性小鼠中则未观察到显著钝化。更重要的是，CORT水平与海马内GR敏感基因（如Fkbp5）的表达或整体转录反应强度之间没有显著相关性。这表明转录组的 habitu 化在很大程度上独立于外周CORT水平的变化，指向了中枢神经系统内部的适应机制。

染色质可及性不解释分子 habitu 化

为了探究 habitu 化是否由染色质结构的改变所驱动，研究人员对同一批动物的对侧海马进行了ATAC-seq分析。他们确认在急性应激45分钟后，染色质可及性确实发生改变，特别是在GR结合位点（糖皮质激素反应元件，GRE）的可及性显著增加。然而，无论是基线水平还是对急性应激的反应，10天的CRS并未引起全组织水平上显著的染色质可及性变化。因此，整体染色质可及性的改变无法解释观察到的转录 habitu 化。

单细胞水平的转录组动力学与 habitu 化

鉴于批量测序可能掩盖细胞类型特异性的变化，研究团队对经历了10天处理或CRS的雌性小鼠海马进行了单核多组学测序（RNA+ATAC），时间点包括应激后15分钟、45分钟和3小时。他们成功鉴定了包括兴奋性神经元、抑制性神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管细胞在内的多种细胞类型。分析发现，所有主要细胞类型都对急性应激有反应，但动力学和强度各异：神经元（特别是CA1、前下托和VIP中间神经元）反应迅速（15-45分钟），而神经胶质细胞的反应则更为持久（至3小时）。重要的是，转录组的 habitu 化现象普遍存在于各个细胞类型中。

habitu 化后更少的细胞被激活

利用基于应激反应基因表达谱开发的活动依赖性转录(ADT)评分，研究人员能够估计单个细胞近期的激活状态。他们发现，转录反应的钝化主要是由于响应应激的细胞数量减少，而非每个细胞的反应强度减弱。在经历了CRS的动物中，被激活的神经元（特别是VIP中间神经元、CA1和前下托神经元）和胶质细胞（尤其是星形胶质细胞和少突胶质细胞）的比例显著下降。

重复应激缩短了跨细胞类型的GRE可及性

单核ATAC-seq分析显示，GR motif（即GRE）的可及性在应激后15分钟即在所有细胞类型中增加，并且在处理组和CRS组之间此时没有差异。然而，在45分钟和3小时，CRS动物中GRE的可及性增加被削弱或更快地返回基线。与此一致，GR靶基因Fkbp5的转录上调在CRS动物中也出现钝化和缩短。值得注意的是，这种GRE可及性的缩短现象在激活和非激活的神经元中均存在，表明这是一种普遍性的GR信号通路改变，与细胞的电活动激活状态无关。

重复应激诱导cAMP相关转录因子的差异

对于与早期激活相关的转录因子，如CREB1和SRF，其motif可及性在激活的神经元中确实增加。然而，在CRS动物的激活神经元中，SRF motif可及性的增加被削弱，提示神经元激活的强度或持续时间可能发生变化。这与早期IEGs表达 habitu 化的机制相关联。

综上所述，这项研究通过多组学和时间动态分析，清晰地描绘了小鼠海马对重复应激的转录组适应图谱。研究结论指出，转录组的 habitu 化主要由两个在时间和机制上可分离的过程驱动：首先，一个快速的、GR非依赖的机制，其特征是早期基因（特别是IEGs）的激活被削弱，这主要与响应应激的细胞数量减少有关，并涉及cAMP/CREB信号通路。其次，一个延迟的、GR依赖的机制，其特征是GR靶基因的转录反应被缩短，这似乎是由于GR在细胞核内的停留时间缩短所致，并且与外周CORT水平的变化关系不大。

这项研究的意义重大。它首次在全基因组水平和单细胞分辨率下系统阐述了应激 habitu 化的分子机制，将以往观察到的现象（如Fos habitu 化和HPA轴 habitu 化）整合到一个统一的框架下，并揭示了它们之间可能存在的解离。研究所产生的 comprehensive 数据集已作为可交互的开放资源提供，为未来研究应激相关疾病的个体差异、寻找新的治疗靶点以及深入理解GR信号调控的精细机制奠定了坚实的基础。尽管研究存在一些局限性，如时间分辨率在极早期仍有不足、仅关注了海马脑区以及使用了细胞核而非完整细胞进行测序，但其发现无疑深化了我们对大脑适应性可塑性的认识，为理解为何有些人能更好地应对慢性压力而另一些人则发展为疾病提供了重要的分子线索。