Clair3-RNA：基于深度学习的纳米孔长读长RNA测序小变异识别新方法

《Nature Communications》：Clair3-RNA: a deep learning-based small variant caller for long-read RNA sequencing data

为解决长读长RNA测序（lrRNA-seq）变异识别中高错误率、覆盖度不均和RNA编辑事件干扰等难题，香港大学团队开发了首个深度学习变异识别工具Clair3-RNA。该工具通过覆盖度归一化、单倍型定相等创新技术，在PacBio和ONT平台分别实现98.59%和97.16%的SNP识别F1值，显著优于现有方法，为转录组变异分析提供了精准解决方案。

　　

在基因组学研究领域，RNA测序（RNA-seq）技术如同一位高精度的"转录组摄影师"，能够捕捉细胞中基因表达的动态画面。然而传统短读长测序就像用碎片拼图，难以还原全长转录本的真实面貌。随着太平洋生物科学（PacBio）和牛津纳米孔（ONT）等长读长测序技术的崛起，科研人员终于获得观测全长转录本的"超广角镜头"，但新的挑战也随之浮现——这些技术固有的高错误率（1-5%）、转录本覆盖度不均以及RNA编辑事件（如A-to-I编辑）的干扰，使得从测序噪音中精准识别真实基因变异变得异常困难。

目前主流变异识别工具多针对DNA测序数据设计，直接应用于RNA数据时效果不佳。虽然已有研究尝试通过序列比对转换等方式改造DNA变异识别工具，但尚未出现专为长读长RNA测序（lrRNA-seq）特性量身定制的解决方案。这种技术空白严重制约了科研人员利用lrRNA-seq数据开展精准转录组变异分析的潜力。

近日，《Nature Communications》发表了香港大学团队开发的Clair3-RNA，这是首个基于深度学习的长读长RNA测序小变异识别工具。该研究通过多任务双向长短期记忆（Bi-LSTM）神经网络架构，结合创新性的覆盖度归一化、变异合子性翻转和RNA编辑位点标记等技术，在PacBio Iso-Seq、MAS-Seq和ONT dRNA004等多个平台上实现了突破性性能。特别值得关注的是，通过引入单倍型定相信息，该工具在至少有10条支持读长且忽略合子性的条件下，SNP识别F1值最高可达98.59%，为转录组变异分析树立了新标杆。

关键技术方法方面，研究团队利用基因组标准样本（GIAB）HG002数据集进行模型训练，采用覆盖度归一化策略平衡RNA测序数据特有的表达量差异，通过REDIportal数据库整合已知RNA编辑位点信息，并创新性地将单倍型定相特征融入神经网络输入。针对PacBio和ONT平台特性，研究还优化了minimap2剪切比对参数，系统评估了不同测序技术（包括ONT最新SQK-RNA004试剂盒）对变异识别性能的影响。

生成可调用高置信度基准区域进行评估

研究团队创新性地定义了RNA测序特有的可调用区域标准，通过结合测序覆盖度要求与GIAB高置信区域，建立了公平的评估框架。该方法充分考虑了RNA数据中由于等位基因特异性表达导致的合子性翻转现象，为准确评估工具性能奠定基础。

ONT平台性能表现

在六种ONT数据集（包括cDNA、dRNA002和最新dRNA004）的测试中，Clair3-RNA展现出显著优势。使用dRNA004数据时，在覆盖度≥4的条件下SNP F1值达到91.00-91.73%，较LongcallR和Clair3分别提高约30%和15%。特别值得注意的是，dRNA004试剂盒将平均错误率从9.7%降至1.8%，数据通量提升6倍，直接带动了所有工具性能的普遍提升。

PacBio平台性能表现

在PacBio Iso-Seq和MAS-Seq数据上，Clair3-RNA同样表现卓越，SNP F1值稳定在91%以上。研究还发现，使用minimap2比对的专用剪切模式相比pbmm2能进一步降低25.42%的假阳性，这一发现为长读长RNA数据分析提供了重要方法学参考。

测序覆盖度和等位基因深度分析

研究表明，提高最低覆盖度要求可有效提升识别精度——当覆盖度从4提升至10时，ONT dRNA004数据的精确度和召回率分别提高1.87%和3.25%。这一发现为不同覆盖度数据的质量控制提供了实用阈值参考。

RNA数据集中的合子性翻转分析

研究人员发现忽略合子性判断可平均提高2.43-2.88%的F1值，这一现象源于RNA数据中单倍型优势表达导致的合子性翻转。该发现提示在临床RNA数据分析中，需要谨慎解读合子性信息。

基因组背景下的性能分析

在GIAB定义的困难区域（如低复杂度区域、片段重复区）中，Clair3-RNA表现出更强鲁棒性。特别是在编码序列（CDS）区域，其SNP F1值达到94.58%，显著优于对比工具。

插入缺失（Indel）性能

Indel识别仍是技术难点，Clair3-RNA在PacBio平台上达到89.42%的F1值，但在ONT平台上仅为66.50%。这种差异主要源于纳米孔数据中不同长度Indel信号聚集对模型判断的干扰。

使用REDIportal数据库进行RNA编辑标记

通过整合REDIportal数据库中经多源验证的RNA编辑位点，工具可有效区分真实变异与编辑事件。在PacBio数据中，这一策略帮助识别了5,677个高质量编辑位点。

A-to-G和T-to-C假阳性分析

针对RNA编辑中最常见的A-to-G和T-to-C假阳性，Clair3-RNA展现出卓越的区分能力，其假阳性数量仅为Clair3的1/10。结合REDIportal标注，可进一步将假阳性减少62.77%。

利用定相信息提升变异识别性能

研究首次证实单倍型定相在lrRNA-seq中的有效性，通过将12个定相特征融入神经网络，使SNP和Indel的F1值分别提升1.52%和5.86%。这一突破为利用长读长优势提升RNA数据分析精度开辟了新途径。

GENCODE注释基因分析

在GENCODE注释的蛋白质编码基因中，Clair3-RNA在PacBio和ONT平台上分别实现58.1%和60.0%的基因无变异识别错误，展现了在功能基因组研究中的应用潜力。

研究结论表明，Clair3-RNA通过深度学习架构与RNA测序特性的深度融合，有效解决了lrRNA-seq变异识别中的关键技术瓶颈。工具在PacBio和ONT多平台上的稳定性能，为转录组变异分析提供了可靠解决方案。特别是其对RNA编辑事件的识别能力和单倍型定相技术的成功应用，为研究等位基因特异性表达和RNA修饰等功能基因组学问题提供了新可能。

尽管在Indel识别和剪切位点附近变异检测方面仍有提升空间，但该研究无疑为长读长RNA测序数据分析树立了新标准。随着测序技术的持续进步和算法模型的不断优化，Clair3-RNA有望成为转录组变异分析领域的核心工具，推动精准医学和功能基因组学研究的深入发展。该研究的开源策略（BSD 3-Clause许可证）也将促进算法透明化和科学共同体协作，助力生命医学研究创新。