黄病毒E蛋白疫苗的理性设计：增强免疫原性并规避抗体依赖性增强风险

《Nature Communications》：Rational design of flavivirus E protein vaccine optimizes immunogenicity and mitigates antibody dependent enhancement risk

本研究针对黄病毒疫苗开发中存在的抗体依赖性增强(ADE)风险，通过结构生物学指导的理性设计，在ZIKV、JEV和WNV等多种黄病毒E蛋白中引入G5C/G102C突变，构建了稳定的二聚体免疫原CC_FLE sE。该设计通过形成链间二硫键，有效遮蔽了易引发ADE的融合环表位(FLE)，同时优化了中和抗体表位的呈现。研究证实，该疫苗候选物在小鼠模型中不仅能诱导高滴度的中和抗体，提供对ZIKV的完全保护，还能显著降低对DENV感染的ADE风险，为开发安全有效的泛黄病毒疫苗提供了新策略。

　　

在病毒的世界里，黄病毒家族是一群臭名昭著的“亲戚”，它们包括寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗河病毒(WNV)等。这些病毒主要通过蚊虫叮咬传播，在全球范围内造成了巨大的疾病负担。其中，寨卡病毒在2016年曾引发全球公共卫生危机，因其感染孕妇可能导致胎儿严重的神经系统畸形，至今仍无获批的疫苗。

开发黄病毒疫苗面临一个巨大的科学难题：抗体依赖性增强(ADE)。简单来说，当一个人感染过一种黄病毒（如登革病毒）或接种了某种黄病毒疫苗后，体内产生的抗体有时不仅不能保护他，反而会“帮助”另一种黄病毒（如寨卡病毒）更轻松地进入人体细胞，导致更严重的疾病。这种现象在登革病毒中尤为突出，也是此前登革疫苗研发失败的主要原因之一。

ADE的“罪魁祸首”之一，是黄病毒E蛋白上一个高度保守的区域——融合环表位(FLE)。这个表位在不同黄病毒之间长得非常像，因此容易诱导产生“交叉反应”的抗体。然而，这些抗体往往“战斗力”不强，无法有效中和病毒，反而会像一把“特洛伊木马”的钥匙，通过结合细胞表面的Fc受体，把病毒“请”进细胞，从而加重感染。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了病毒表面的E蛋白，这是中和抗体的主要靶点。在成熟的病毒颗粒上，E蛋白以二聚体的形式存在，此时FLE被巧妙地“藏”在蛋白内部，不易被抗体识别。然而，传统的重组可溶性E蛋白(sE)在体外表达时，往往倾向于形成单体，导致FLE完全暴露，容易诱导产生ADE相关的抗体。

为了模拟病毒天然的二聚体构象，并“锁住”FLE，研究人员开展了一项结构生物学指导的理性设计。他们通过分析ZIKV E蛋白的结构，发现如果将第5位和第102位的甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)，就可以在相邻的两个E蛋白单体之间形成一个全新的二硫键，从而将两个单体牢牢地“拴”在一起。这个设计被命名为CC_FLE sE。理论上，这个设计不仅能稳定E蛋白的二聚体构象，还能通过物理空间位阻，将FLE“藏”在蛋白内部，从而降低其免疫原性。

为了验证这一设计，研究人员首先在体外对CC_FLE sE进行了全面的生化与结构表征。他们发现，与野生型(WT) sE相比，CC_FLE sE确实形成了稳定的二聚体，并且热稳定性显著提高。通过冷冻电镜(cryo-EM)技术，他们成功解析了CC_FLE sE与一种中和抗体SMZAb2的复合物结构，清晰地看到了设计中的二硫键，并证实FLE确实被有效遮蔽。进一步的抗原性分析显示，CC_FLE sE能很好地结合靶向E蛋白二聚体表位(EDE)的中和抗体，但几乎不结合靶向FLE的ADE相关抗体，完美实现了设计目标。

更令人兴奋的是，这种“锁住FLE”的设计具有普适性。研究人员发现，G5和G102这两个位点在多种黄病毒（如JEV和WNV）的E蛋白中都是保守的。当他们将同样的突变引入JEV和WNV的E蛋白时，同样获得了稳定的二聚体，并且FLE的抗原性也显著降低。这表明，CC_FLE设计策略有望应用于开发多种黄病毒的疫苗。

接下来，研究人员在小鼠模型中评估了ZIKV CC_FLE sE作为疫苗候选物的效果。他们发现，当CC_FLE sE与一种名为PCEP-R848的超分子佐剂联合使用时，能诱导产生非常高水平的中和抗体。更重要的是，这些免疫血清在体外和体内实验中，都未表现出对登革病毒感染的ADE效应，而接种野生型sE的对照组则出现了明显的ADE。

为了进一步探究CC_FLE sE诱导的抗体反应的质量，研究人员使用了一种特殊的转基因小鼠模型——OmniMouse。这种小鼠携带了人类多样化的抗体基因库，能够模拟人类对疫苗的免疫应答。从免疫后的OmniMouse小鼠中，他们分离并鉴定了一系列单克隆抗体。其中，一个名为OZ-D4的抗体表现尤为突出。通过冷冻电镜，他们解析了OZ-D4与ZIKV E蛋白二聚体的高分辨率结构，发现OZ-D4能够识别一个跨越两个E蛋白单体的“四聚体表位”，这与之前报道的强效中和抗体EDE1-C8识别的表位非常相似。这表明，CC_FLE sE疫苗能够有效激活并扩增那些能够产生强效保护性抗体的B细胞。

综上所述，这项研究通过巧妙的蛋白质工程，成功设计出了一种新型的黄病毒E蛋白免疫原CC_FLE sE。该设计不仅稳定了E蛋白的保护性构象，还通过遮蔽ADE相关的FLE表位，从源头上降低了疫苗引发ADE的风险。在动物模型中，该疫苗候选物展现出了强大的保护效力，并能诱导产生靶向关键中和表位的高质量抗体反应。这项研究为开发安全、有效的泛黄病毒疫苗提供了一条充满希望的新路径，相关成果已发表在《自然·通讯》(Nature Communications)杂志上。

关键实验技术

本研究主要运用了结构生物学指导的蛋白质理性设计、蛋白质表达与纯化、冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒重构技术、生物层干涉技术(BLI)进行抗原抗体亲和力分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗原性表征、体外中和试验（包括报告病毒颗粒RVP和空斑减少中和试验PRNT）、抗体依赖性增强(ADE)体外和体内模型评估、以及利用OmniMouse转基因小鼠模型进行人类B细胞库应答分析。

研究结果

1. 基于结构的ZIKV E蛋白疫苗设计

研究人员通过结构分析发现，在E蛋白二聚体构象中，融合环表位(FLE)的可及表面积(ASA)比单体构象减少了80%以上。为了模拟这种天然构象并遮蔽FLE，他们设计了两种二聚体突变体：CC_FLE sE（引入G5C/G102C突变，在FLE和相邻单体的N端之间形成二硫键）和CC_Core sE（引入A264C突变，在二聚体核心形成二硫键）。此外，还构建了缺失FLE所在区域的DI-DIII和DIII蛋白，以及DIII-纳米颗粒(DIII-NP)融合蛋白作为对照。

2. 理性设计的ZIKV E蛋白免疫原的抗原性、热稳定性和结构

生化表征显示，CC_FLE sE和CC_Core sE均能形成稳定的二聚体。其中，CC_FLE sE的热稳定性显著提高，熔解温度(T_m)比野生型(WT) sE提高了15°C。冷冻电镜结构解析证实，CC_FLE sE形成了对称的二聚体，并清晰地展示了设计的C5-C102二硫键。抗原性分析表明，CC_FLE sE能有效结合靶向E蛋白二聚体表位(EDE)的中和抗体，同时几乎完全丧失了与FLE特异性抗体的结合能力，而CC_Core sE对FLE抗体的结合能力也显著降低。

3. CC_FLE设计可应用于其他黄病毒sE以预防ADE

序列比对和结构分析表明，G5和G102位点在JEV和WNV等黄病毒中高度保守。研究人员成功表达了JEV和WNV的CC_FLE sE突变体，证实它们同样形成了稳定的二聚体，并且对FLE特异性抗体的结合能力显著降低（降低7至300倍），表明该设计策略具有普适性。

4. CC_FLE在免疫小鼠中诱导强效的nAb反应

在小鼠免疫实验中，CC_FLE sE诱导的中和抗体滴度与WT sE相当，而CC_Core sE的免疫原性则较差。当CC_FLE sE与PCEP-R848超分子佐剂联合使用时，诱导的中和抗体滴度显著高于单独使用PCEP或R848佐剂，甚至优于WT sE加佐剂组。被动血清转移实验进一步证实，CC_FLE sE免疫血清能有效保护AG129小鼠免受ZIKV攻击。

5. CC_FLE突变基本消除了增强DENV感染的ADE潜力

体外ADE实验显示，WT sE免疫血清能显著增强DENV-1和DENV-2的感染，而CC_FLE sE免疫血清则未表现出明显的ADE效应。体内实验也证实，与WT免疫血清相比，CC_FLE免疫血清不会导致AG129小鼠在DENV-2攻击后出现更严重的死亡或更高的病毒载量。

6. ZIKV二聚体CC_FLE sE诱导的nAb反应与单体WT sE相比具有独特的质量

血清抗体耗竭实验表明，WT sE诱导的nAb反应主要针对DIII表位。而CC_FLE sE诱导的nAb反应则更为复杂，既包含针对四聚体表位的抗体，也包含针对DIII表位的抗体，表明其诱导的抗体反应质量更高。

7. ZIKV CC_FLE sE免疫在免疫活性小鼠中提供近乎完全的保护

在BALB/c小鼠模型中，CC_FLE sE加PCEP-R848佐剂免疫组诱导的中和抗体滴度是WT sE加佐剂组的28倍。攻毒实验显示，该免疫组的小鼠在感染后第1天和第10天，血清和淋巴结中的病毒载量均显著降低，且83%的小鼠血清中检测不到病毒RNA。相关性分析显示，攻毒前的nAb滴度与攻毒后的病毒载量呈负相关。

8. ZIKV CC_FLE sE在妊娠期小鼠中的保护效力

在妊娠期小鼠模型中，CC_FLE sE免疫同样诱导了高水平的nAb。攻毒后，免疫组母鼠的血清和子宫病毒载量显著降低，且胎盘和胎儿组织中均未检测到病毒RNA，证明该疫苗能有效保护母鼠和胎儿。

9. ZIKV CC_FLE sE诱导的抗体/B细胞反应的高分辨率分析

利用OmniMouse模型，研究人员从CC_FLE sE免疫小鼠中分离出多种单克隆抗体。其中，OZ-D4抗体被鉴定为一种靶向四聚体表位的强效中和抗体。冷冻电镜结构解析显示，OZ-D4的识别表位与经典的EDE抗体部分重叠，但其结合角度更为“侧向”。

10. OZ-D4克隆亲和力成熟及免疫诱导

序列分析发现，OZ-D4重链的氨基酸序列与其推断的胚系序列完全一致，轻链仅有8.1%的体细胞高频突变(SHM)，且其接触表位的残基大多为胚系残基。将OZ-D4回复至胚系版本(OZ-D4_GL)后，其仍能有效结合二聚体sE并具有一定的中和活性，表明CC_FLE sE能够有效激活针对EDE表位的胚系前体B细胞。

结论与讨论

本研究通过结构指导的理性设计，成功开发了一种新型的黄病毒E蛋白免疫原CC_FLE sE。该设计通过在FLE和N端之间引入二硫键，不仅稳定了E蛋白的二聚体构象，还显著降低了FLE的免疫原性，从而在诱导强效保护性免疫应答的同时，有效规避了抗体依赖性增强(ADE)的风险。

研究证实，CC_FLE设计策略具有普适性，可应用于ZIKV、JEV和WNV等多种黄病毒。在小鼠模型中，ZIKV CC_FLE sE疫苗候选物展现出卓越的保护效力，并能诱导产生靶向关键中和表位（如四聚体EDE表位）的高质量抗体反应。此外，利用OmniMouse模型分离到的OZ-D4抗体，其胚系前体即能有效识别二聚体sE，这为CC_FLE sE在人类B细胞库中诱导有效应答提供了有力证据。

综上所述，CC_FLE sE代表了一种极具前景的黄病毒疫苗开发策略，为最终实现安全、有效的泛黄病毒疫苗奠定了坚实的基础。