Gemini双功能自扩增表达平台：实现无脂质纳米颗粒疫苗和纳米医学的新一代技术

《Nature Communications》：A binary self-amplifying expression platform enabling lipid nanoparticle-free vaccines and nanomedicines

本研究报道了Gemini双功能自扩增表达平台，该平台通过兼具自扩增RNA(saRNA)和自扩增DNA(saDNA)功能的双功能启动子，成功解决了传统mRNA疫苗对LNP递送的依赖问题。实验证明，Gemini平台无需LNP封装即可实现长期蛋白表达，在冻融循环和冻干条件下表现出优异稳定性，并能诱导持久的免疫应答，为疫苗开发和纳米医学提供了创新解决方案。

　　

在新冠疫情期间，mRNA疫苗展现了快速研发的优势，但其广泛应用仍面临诸多挑战。传统mRNA疫苗存在稳定性差、依赖脂质纳米颗粒(LNP)递送系统、生产工艺复杂等问题。LNP不仅可能引起不良反应，还限制了疫苗的储存和运输条件，特别是在资源匮乏地区。此外，mRNA疫苗的表达时间较短，可能影响免疫保护的持久性。这些局限性促使科学家们寻求新一代的疫苗技术平台。

为了突破这些技术瓶颈，不列颠哥伦比亚大学Wilfred A. Jefferies教授团队在《Nature Communications》上发表了题为"Gemini双功能自扩增表达平台实现无脂质纳米颗粒疫苗和纳米医学"的研究成果。该研究开发了一种创新的Gemini平台，能够同时作为自扩增RNA(saRNA)和自扩增DNA(saDNA)发挥作用，为疫苗和基因治疗提供了新的技术路径。

研究人员主要采用了分子克隆、细胞转染、蛋白质印迹、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点(ELISPOT)和小鼠模型等关键技术方法。其中使用了K18-hACE2转基因小鼠作为SARS-CoV-2感染的动物模型，并通过假病毒中和实验评估疫苗免疫效果。

Both Gemini saRNA and saDNA induce amplification in transfected cells

研究人员首先构建了Gemini 1.0载体，该载体包含原核T7启动子和真核CMV启动子，可分别用于产生saRNA和saDNA。通过RT-PCR检测负链mRNA的表达，证实了该平台在HEK293细胞中的自我扩增能力。实验显示，无论是saRNA还是saDNA形式，都能在无药物选择的情况下实现高效转染和扩增。

Both Gemini saRNA and saDNA drive protein expression in transfected cells

为了验证Gemini平台的蛋白表达能力，研究人员用表达SARS-CoV-2 Delta变异株刺突蛋白的LNP封装saRNA和saDNA转染HEK293细胞。Western blot和流式细胞术分析表明，两种形式都能驱动蛋白表达，且表达持续时间显著长于传统LNP-mRNA。到第6天，LNP-saDNA和LNP-saRNA的阳性细胞比例分别达到26.0%和33.2%，而LNP-mRNA则降至6.08%。

Extended eGFP expression from LNP-encapsulated Gemini saDNA and saRNA in vitro

通过eGFP报告基因实验进一步评估表达持续时间。结果显示，LNP-saDNA在转染28天后仍保持92.7%的eGFP阳性细胞，而LNP-saRNA为63.5%。相比之下，传统LNP-mRNA在6天内表达急剧下降。这表明Gemini平台能够实现长期稳定的蛋白表达。

The Gemini platform expresses payload proteins for an extended period in vivo

在小鼠体内实验中，LNP-saDNA组的eGFP表达随时间逐渐增加，在42天时达到峰值，而LNP-saRNA在14天时表达最高，随后逐渐下降。两种形式的表达持续时间均显著优于传统的LNP-pDNA和LNP-mRNA。

Neither Gemini saRNA nor saDNA induce significant genomic integration

安全性评估显示，saRNA形式未检测到基因组整合，saDNA的整合频率约为3.4×10^-5/细胞基因组，低于质粒DNA(5×10^-5)和腺病毒(6.7×10^-5)，远低于自发突变频率，表现出良好的安全性。

Stability of naked Gemini saDNA and saRNA to freeze-thaw cycles and lyophilization compared to conventional LNP-encapsulated mRNA vaccine

稳定性测试表明，裸露的saDNA和saRNA在5次冻融循环和冻干处理后仍保持完整，而LNP-mRNA在一次冻融后即发生LNP结构解体，mRNA释放。这凸显了Gemini平台在储存和运输方面的优势。

LNP encapsulation is not required to achieve potent immunogenicity from Gemini saDNA or saRNA vaccines

重要的是，研究发现无需LNP封装，裸露的Gemini疫苗也能诱导强烈的免疫应答。高剂量的裸露saDNA(50μg)在诱导抗体反应方面优于低剂量LNP-saDNA(5μg)。在细胞免疫应答方面，裸露saDNA诱导了更强的IFN-γ反应，表明其能有效激发Th1型免疫应答。

Significant antibody response induced by both Gemini SARS-CoV-2 spike naked saRNA and naked saDNA vaccine formats

免疫应答特征分析显示，裸露saDNA主要诱导IgG抗体反应，而saRNA则倾向于诱导IgM反应。这种差异可能与RNA和DNA激活不同的Toll样受体(TLR)信号通路有关，为针对不同需求定制免疫应答提供了可能。

Durability of antibody responses induced by naked saDNA and saRNA vaccines

抗体持久性研究表明，裸露saRNA疫苗的抗体反应可持续42天，而saDNA疫苗的抗体反应至少维持70天，显示出更持久的免疫保护潜力。

Effectiveness of naked saDNA in reducing viraemia post-challenge

病毒攻击实验证实，裸露saDNA疫苗接种使SARS-CoV-2病毒血症降低91%，优于LNP-saDNA的68%降低率。这表明裸露saDNA疫苗在控制病毒感染方面具有显著优势。

该研究的讨论部分强调，Gemini平台通过其独特的双功能设计，成功解决了传统核酸疫苗的多个关键限制。其最大的创新在于突破了LNP递送系统的依赖，同时实现了长效表达和大容量基因载荷(最高可达19kb)的递送。与需要-20°C至-80°C储存的传统mRNA疫苗不同，Gemini平台在2°C至8°C条件下保持稳定，极大简化了冷链物流要求。

值得注意的是，Gemini平台展示了可调节的表达持续时间：saDNA适合需要长期表达的临床应用，而saRNA更适合短期表达需求。这种灵活性扩展了其在疫苗、基因治疗和蛋白质替代疗法等领域的应用前景。

在免疫应答方面，单剂Gemini疫苗即可诱导强烈的抗体和T细胞应答，其中和抗体滴度超过恢复期患者水平，在动物模型中展示了91%的病毒血症降低效果。这些结果表明Gemini平台具有实现灭菌免疫的潜力。

综上所述，Gemini平台作为一种新一代核酸递送系统，在安全性、稳定性、生产工艺和免疫效果方面均展现出显著优势，不仅为疫苗开发提供了新范式，也为基因治疗和纳米医学应用开辟了新途径。该技术的成功开发将有助于推动疫苗公平可及性，增强全球公共卫生应急准备能力。