内体-吞噬泡连接组装体（EPLA）：靶向降解膜蛋白和胞外蛋白的新型自噬技术平台

《Nature Communications》：Endosome-phagophore linking assemblies for the degradation of membrane/extracellular proteins

本研究针对LYTACs等技术降解膜/胞外蛋白时存在的受体依赖性、潜在钩状效应等问题，开发了一种名为内体-吞噬泡连接组装体（EPLA）的新型靶向蛋白降解技术。研究人员通过将靶向配体与内体表面锚定的吞噬泡靶向肽（ES-PTP）结合，成功构建了能够特异性降解PD-L1、RAGE、Aβ、tau等多种疾病相关蛋白的EPLA系统，证实其通过"内体-吞噬泡-溶酶体"非经典运输途径实现蛋白降解，为拓展自噬降解靶点谱提供了新的技术平台。

　　

在生物医学研究领域，靶向蛋白降解（TPD）技术正掀起一场治疗革命。这类技术能够利用细胞自身的降解机制，特异性清除疾病相关的致病蛋白，为传统"不可成药"靶点提供了新的干预策略。目前主流的蛋白降解技术主要依赖于泛素-蛋白酶体系统（UPS）和溶酶体途径，特别是近年来兴起的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）技术，为膜蛋白和胞外蛋白的降解提供了新思路。

然而，LYTAC技术面临着严峻挑战：其降解效率高度依赖于细胞表面溶酶体导向受体的表达水平和动力学特征，复杂的分子设计和合成过程限制了其广泛应用，而且双功能嵌合体可能产生"钩状效应"，影响降解特异性。这些局限性促使科学家们寻找更加通用、简单的技术范式来升级膜蛋白和胞外蛋白的降解平台。

大多数膜蛋白和胞外蛋白能够通过组成型内吞作用（如程序性死亡配体1 PD-L1）或受体介导的内吞作用（如微管相关蛋白tau）进入细胞。值得注意的是，内化后的蛋白质只有少量被运输至溶酶体降解，大部分通过循环内体返回质膜或胞外空间。与此同时，在所有真核细胞中，开放的自噬吞噬泡能够选择性包裹细胞内受损组分并将其运输至溶酶体降解。基于这些生物学特性，苏州大学韩亮团队提出了一个创新性设想：能否将内体途径与自噬机制相结合，建立一条"内体-吞噬泡-溶酶体"的非经典运输途径，用于降解膜蛋白和胞外蛋白？

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员开发了一种名为内体-吞噬泡连接组装体（EPLA）的新型降解技术。该技术的核心在于一种内体表面锚定的吞噬泡靶向肽（ES-PTP），它由pH低插入肽（pHLIP）和吞噬泡结合元件组成。pHLIP能够在酸性条件下插入细胞膜，而吞噬泡结合元件则能够靶向自噬相关蛋白。通过将特异性靶向配体连接至pHLIP的N端，将吞噬泡靶向基团连接至C端，形成的EPLA能够识别并结合目标蛋白，随之内化进入内体，在酸性内体环境中插入内体膜，将吞噬泡靶向基团锚定在内体表面，进而招募吞噬泡，实现目标蛋白的自噬降解。

研究团队运用了多项关键技术方法开展本研究。他们通过肽段合成与化学缀合技术构建了ES-PTP和EPLA，利用红细胞溶血实验评估了工程化肽段的膜扰动效应，采用动态光散射和zeta电位分析表征了组装体的物理化学性质。在细胞水平，研究人员通过流式细胞术、共聚焦显微镜、蛋白质印迹等技术分析了EPLA的细胞内吞、细胞内运输、蛋白降解效率及机制。此外，还通过蛋白质组学分析评估了降解特异性，并利用小鼠肿瘤模型进行体内疗效和安全性评价。

Construction and characterization of ES-PTPs and EPLAs

研究人员首先设计并表征了ES-PTP和EPLA。他们工程化了一系列内体溶解肽和pHLIP，在其N端引入马来酰亚胺（Mal），C端连接LC3靶向肽Q24（源自USP30的跨膜结构域）。红细胞溶血实验显示，所有工程化肽段在酸性条件下（模拟内体环境）均能引起血红蛋白释放，而在中性条件下对质膜损伤较小，表明它们具有pH依赖性的膜插入能力。其中，Mal-pHLIP-Q24被选为ES-PTP，因其能够在酸性pH下将C端插入脂质膜，从而将LC3靶向Q24锚定在内体表面。

随后，研究团队将ES-PTP与靶向配体（如PD-L1靶向的CVR、RAGE靶向的ELK、Aβ靶向的RGT）缀合，构建了相应的EPLA。这些组装体显示出48-177纳米的流体动力学直径和较低的多分散指数，表明可能形成胶束样结构。临界胶束浓度测定显示它们在1.2-6.8纳米的低浓度下即可形成组装体。血浆蛋白吸附实验表明，这些组装体与PEG化胶束类似，可能具有"隐形"特性和长血液循环时间。

The proximity of PD-L1(endosome) to phagophore(lysosome)

以PD-L1为模型膜蛋白，研究人员深入研究了CVR-EPLA的作用机制。细胞摄取实验表明，CVR-EPLA能够通过PD-L1介导的内吞作用有效进入细胞，这一过程涉及网格蛋白、巨胞饮、脂筏和小窝蛋白等多种内吞途径。共聚焦显微镜观察显示，CVR-EPLA处理能够显著增加PD-L1与早期内体标记物Rab5的共定位，并诱导PD-L1-containing内体与吞噬泡标记物LC3和溶酶体标记物LAMP1的空间接近。这些结果证明CVR-EPLA能够将PD-L1-containing内体转运至吞噬泡和溶酶体。

The autophagy-based PD-L1 degradation

Western blot分析证实，CVR-EPLA能够以浓度和时间依赖的方式有效降解PD-L1，而缺乏LC3靶向Q24的CVR-pHLIP则无此效果。机制研究表明，CVR-EPLA介导的PD-L1降解依赖于自噬机制，因为溶酶体酸化抑制剂Bafilomycin A1、自噬流抑制剂氯喹、自噬抑制剂NH₄Cl能够抑制降解，而自噬增强剂雷帕霉素能够促进降解。相反，蛋白酶体抑制剂MG132对降解无影响。在Atg5敲低的细胞中，CVR-EPLA无法降解PD-L1，进一步证实了LC3-II在降解过程中的关键作用。

The modularity and universality of EPLA technology

为验证EPLA技术的模块性和普适性，研究人员将其应用于多种疾病相关蛋白的降解。在阿尔茨海默病模型中，RAGE靶向的ELK-EPLA能够降解约56.2%的RAGE，而Aβ靶向的RGT-EPLA则能降解细胞内化的Aβ寡聚体。共定位实验显示，RGT-EPLA处理能够诱导内化的Aβ寡聚体与吞噬泡和溶酶体的共定位。

为进一步拓展应用范围，研究团队开发了纳米颗粒基的EPLA@NPs，通过PLGA-PLL和MAL-PEG-SCM，利用超声乳化溶剂蒸发技术、琥珀酰亚胺-氨基反应化学和马来酰亚胺-硫醇反应化学，在纳米颗粒表面同时展示靶向配体和ES-PTP。这种设计不仅能够包载亲水和疏水靶向配体，还便于冻干储存和商业化。实验证明，CVR-EPLA@NPs能够特异性降解PD-L1（约61.7%），而不影响控制膜蛋白LRP1的水平。

研究人员还验证了EPLA@NPs对多种膜蛋白的降解效果，包括GRP94（50.1%）、PSMA（67.2%）、ICAM-1（50.7%）。通过将LC3靶向Q24替换为能够结合所有六种哺乳动物ATG8家族蛋白的E16肽，构建的p32靶向AKR-EPLA@NPs和VCAM-1靶向VHP-EPLA@NPs分别能够降解64.1%的p32和57.7%的VCAM-1，进一步证明了该技术的模块性。

Tau degradation by EPLA@NPs

针对阿尔茨海默病中tau蛋白的细胞间传播，研究团队构建了tau靶向的VQI-EPLA@NPs。实验表明，tau的内化依赖于LRP1介导的内吞作用，而VQI-EPLA能够促进tau的内化和降解，同时伴随LRP1的降解，提示可能形成了VQI、tau和LRP1的三元复合物。在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中，VQI-EPLA共同孵育能够显著提高tau的降解效率（约91%），远高于无VQI-EPLA时的降解水平（约54%）。

PD-L1 degradation induces in vivo antitumor immunotherapy

最后，研究团队在4T1乳腺癌小鼠模型中评估了CVR-EPLA的抗肿瘤效果。体内实验表明，CVR-EPLA治疗能够显著抑制肿瘤生长和肺转移，降低肿瘤PD-L1水平（约69%），并增加肿瘤浸润CD4⁺和CD8⁺T细胞。与抗PD-L1抗体相比，CVR-EPLA治疗引起的免疫相关副作用更小。同样，CVR-EPLA@NPs也显示出良好的抗肿瘤效果和安全性。

研究结论与讨论部分指出，EPLA技术通过将靶向配体与吞噬泡靶向基团分别连接至pHLIP的N端和C端，建立了一种新型的"内体-吞噬泡-溶酶体"降解途径。该技术成功降解了多种膜蛋白和胞外蛋白，包括PD-L1、RAGE、GRP94、PSMA、ICAM-1、p32、VCAM-1、LRP1、Aβ和tau，展示了广泛的适用性。与LYTAC相比，EPLA技术避免了受体依赖性和钩状效应问题，并且由于利用自噬机制而非单纯的溶酶体机制，在溶酶体功能障碍的疾病中可能具有独特优势。

然而，研究也指出了一些需要进一步解决的关键问题：EPLA如何在pH变化下解离以插入内体膜；EPLA-靶蛋白复合物是否可能从内体泄漏并直接转运至吞噬泡；复合物是否可能在内体中解离使EPLA循环利用。未来可通过筛选更高特异性和亲和力的靶向配体（如单克隆抗体）、优化ES-PTP的内体插入和标记能力、开发更有效的吞噬泡靶向配体、联合自噬增强剂（如雷帕霉素和卡马西平）以及溶酶体功能增强化合物，进一步提高EPLA的体内降解效能。

这项研究不仅为膜蛋白和胞外蛋白的靶向降解提供了新的技术平台，也拓宽了自噬机制的应用范围，为多种疾病的治疗策略开发奠定了基础。随着后续研究的深入，EPLA技术有望在生物医学研究和临床治疗中发挥重要作用。