果蝇fru基因同源物调控蜜蜂雄性合作行为及其神经环路基础

《Nature Communications》：The fru gene specifies male cooperative behaviors in honeybee colonies

本研究揭示了蜜蜂(Apis mellifera)雄性特异性转录因子FruM通过调控神经环路的发育和功能，决定雄性在蜂群内的合作行为。研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑、行为追踪和钙成像等技术，发现fru基因特异性控制雄性蜜蜂的社交接近、乞食和交哺行为的发生频率和持续时间，并参与食物储存区定位等行为。该研究不仅阐明了合作行为遗传控制的神经机制，也为社会性昆虫行为进化提供了新见解。

　　

在蜂群这个高度组织化的"超个体"中，成千上万的个体通过精密的合作行为维持着群体的运转。其中，雄性蜜蜂（雄蜂）在蜂群内表现出独特的合作行为：它们不与其他雄性竞争食物或配偶，而是通过一系列特定的社交行为从工蜂那里获得营养丰富的预消化食物。这种交哺行为（trophallaxis）对蜂群的营养分配和信息交流至关重要，但控制这些深度"硬连线"合作行为的神经遗传机制一直是个未解之谜。

发表在《Nature Communications》的这项研究，由德国杜塞尔多夫大学的Sven Kohnen、Martin Beye团队主导，联合法国巴黎萨克雷大学的研究人员，首次揭示了果蝇fru基因在蜜蜂中的同源物如何特异性调控雄性合作行为。研究人员发现，这个被称为fruitless（fru）的BTB锌指转录因子基因，在蜜蜂雄性神经系统中特异性表达，并构成了一个处理多感官信息的神经环路，专门控制社会性行为的发生和维持。

研究团队运用了多项关键技术方法：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建fruP1基因缺失突变体；利用膜锚定GFP标记和免疫组织化学方法解析Fru^M+神经环路的分布和特征；采用计算机辅助行为追踪系统（Bee Behavioral Annotation System, BBAS）定量分析突变体雄蜂在实验蜂群中的行为变化；使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析表皮碳氢化合物（CHCs）组成；并通过体内钙成像技术记录触角叶（AL）对信息素和气味刺激的神经活动。实验所用蜜蜂样本来自德国杜塞尔多夫大学饲养的西方蜜蜂（Apis mellifera）群体。

雄性特异性Fru^M蛋白在神经系统中高度时空限制性表达

研究人员首先解析了fru基因的转录本结构，发现该基因至少有三个启动子（P1-P3），其中仅P1启动子衍生的转录本（fruP1）存在性别特异性剪接。在雄性中，外显子3被跳过，产生编码386-459个氨基酸的雄性特异性Fru^M蛋白异构体；而在雌性中，外显子3被保留，导致提前出现翻译终止密码子，仅产生34个氨基酸的短肽。

通过抗体染色和基因敲除实验，研究团队证实Fru^M蛋白特异性在雄性神经系统中表达，主要分布在脑部和神经节中，在成年雄蜂中脑约1800个细胞中表达，表现出高度的空间和时间限制性。

Fru^M表达细胞参与处理和整合多感官信息

研究人员通过将膜锚定GFP（myrGFP）编码序列插入fru基因位点，实现了对Fru^M+神经元的特异性标记。发现这些神经元广泛分布于多个感觉处理和整合脑区，包括触角叶（AL）的巨小球形结构（macroglomeruli）、蘑菇体（MB）的萼部（calyx）、视叶（optic lobes）以及食管周围神经节（periesophageal neuropils）等。

M表达（Fru^M+）细胞的投射模式。a将myrGFP编码序列插入fru基因组位点。P1：启动子1。绿盒：供体序列，编码膜锚定的myrGFP蛋白和介导两种蛋白质的P2A/T2A肽。b fru^myrGFP和野生型雄性Cluster I（约78个细胞）和Cluster II（约23个细胞）中的Fru^M+神经元胞体。Cluster I（P=0.54，z=0.74）；Cluster II（P=0.33，z=1.0），MWU检验。c两个簇胞体中表达myrGFP的Fru^M细胞比例。所有统计检验均为双侧。（n）图（b）和（c）下方：检查的蜜蜂数量。d fru^myrGFP雄蜂脑的共聚焦图像。F-肌动蛋白（通过鬼笔环肽，品红色）和Fru^M（通过抗GFP，绿色）蛋白的标记。检查了n=8只蜜蜂。左图：中脑中Fru^M+环路的正面、内侧和背面概览。正面：垂直叶（VL）、上内侧前脑（SMP，箭头）和上外侧前脑（SLP，箭头）中的Fru^M+轴突。内侧：蘑菇体（MB）的梗和萼中的Fru^M表达。背面：食管周围神经节（PP，箭头）和食管下区（SEZ，箭头）中的神经元细胞显示Fru^M表达。右图：Fru^M+环路的细节。AL：触角叶。巨小球形结构2（MG2；箭头）中的Fru^M+。LH：侧角。侧角中的Fru^M+（箭头）。AOTu：前视结节。视结节中的Fru⁺细胞（箭头）。MC：内侧萼。基环（br，箭头）、领区（co，箭头）、唇部（li，箭头）中的Fru⁺，以及II型肯扬细胞（KC II，箭头）的Fru^M+胞体。VL：垂直叶。来自唇部（箭头）和外领区（下方箭头）的垂直叶层中的Fru⁺II型肯扬细胞。比例尺100μm。'>

比较分析揭示了Fru^M+环路的性别二态性特征。在雄性中，触角神经的标记更为局限，巨小球形结构为核心区标记，且存在一条连接小叶（lobula）和后外侧前脑（posterior lateral protocerebrum）的雄性特异性视束，这些特征在工蜂中不存在。

fruP1^-雄蜂社会性摄食行为的启动和维持功能异常

在实验蜂群中，研究人员通过二维条形码标记和计算机追踪系统，详细比较了fruP1突变体雄蜂和野生型雄蜂的行为差异。发现突变体雄蜂的乞食行为（begging behavior）和交哺行为（trophallaxis behavior）发生率显著降低（分别降低超过两倍），交哺行为持续时间也明显缩短。

M蛋白活性是蜂群中社会性摄食行为所必需的。a使用二维条形码和计算机追踪在小型蜂群中检查单个fruP1^-和野生型雄蜂的行为。b乞食（P=0.004，z=2.8，MWU检验）和交哺（P=0.005，z=2.7，MWU检验）行为的发生率。c交哺行为的持续时间（P=0.027，z=2.2，MWU检验）。d接近工蜂（P=0.004，z=3.2，MWU检验）和接近雄蜂（P=0.015，z=2.4，MWU检验）的行为发生率。e自我清洁行为的发生率（P=0.21，z=1.2，MWU检验）。f休息时间比例（P=0.3，z=1.0，MWU检验）。g运动行为（P=0.94，z=0.9，MWU检验）。在两个蜂群重复中比较fruP1^-和野生型雄蜂。显示中位数（中间线）及四分位数Q1和Q3。（n）图（b）至（g）下方：检查的雄蜂数量。min分钟，sec秒，m米，h小时。P<0.05；*P<0.01。所有统计检验均为双侧。'>

同时，突变体雄蜂对其他蜂群成员（无论是工蜂还是其他雄蜂）的接近行为也显著减少，表明社交接近行为本身存在缺陷。而自我清洁、休息和运动等基本行为未受影响，说明fru基因特异性调控社会性行为的启动和维持，而非一般运动功能。

其他蜂群内特异性行为同样受损

令人惊讶的是，fruP1突变体雄蜂反复进入含有花粉的巢房（平均每小时17次），而野生型雄蜂从不这样做。突变体和野生型雄蜂均不进入储蜜巢房，进入空巢房的频率也无差异。这种对巢房类型选择的异常，表明Fru^M蛋白参与抑制雄蜂接触花粉储存区的行为，从而减少对集体食物资源的冲突。

突变体雄蜂在蜂群内的空间分布也发生改变，它们在花粉区和空巢区停留时间更长，而在蜂蜜区停留时间更短，表明对食物储存区的分配行为存在异常。

性信息素相关行为受损，但一般感觉运动功能正常

在交配行为方面，fruP1突变体雄蜂对蜂王性信息素9-ODA（9-氧代-2-癸烯酸）的运动反应显著降低，表明Fru^M蛋白也参与性行为的硬连线。然而，突变体对驱避剂苯甲醛、光照和与工蜂接触的反应正常，嗅觉反应（proboscis extension response）和生存率也未受影响，外部和内部解剖结构也无异常，排除了一般感觉运动功能障碍导致行为异常的可能性。

神经纤维网结构和气味处理特征在fruP1^-雄蜂中未受损

为探究Fru^M蛋白的行为编程机制，研究人员检查了化学感受受体表达、神经纤维网解剖结构和嗅觉处理特征。发现fruP1突变不影响嗅觉受体（OR）、味觉受体（GR）等化学感受受体基因的表达，也不影响触角叶的宏观解剖结构，包括四个雄性特异性增大的巨小球形结构。

M蛋白活性对触角叶的性别二态性或气味处理不是必需的。a抗突触蛋白染色的AL形态。μm表示图像代表的深度。检查了n=9 fruP1^-和n=10野生型雄蜂。箭头：巨小球形结构。比例尺：50μm（b）。fruP1^-雄蜂触角叶中由4种气味剂（9-ODA、1-己醇（1-6ol）、IPA和苯甲醛）诱发的钙信号。不同的气味剂诱导不同的球形结构活动模式。相对荧光变化（ΔF/F[%]）以假色码表示。深蓝色：最小反应。红色：最大反应。虚线圆圈：巨小球形结构MG2。c MG2中对性信息素9-ODA以及空气和溶剂对照（iso：异丙醇）的钙反应幅度（ΔF/F[%]）。显示中位数（中间线）和四分位数。fruP1^-（红色）和野生型（蓝色）组之间未检测到差异（基因型效应：P=0.46，F1,24=0.57，双向重复测量方差分析。9-ODA fruP1^-vs. 9-ODA野生型雄蜂：P=0.36，Sidak多重比较检验）。在两种情况下，对9-ODA的反应均显著大于对照（气味效应：P<0.0001，F2,48=65.25，双向重复测量方差分析。9-ODA vs. iso对照：P<0.0001，Tukey事后检验。fruP1^-（红色）：n=10。野生型（蓝色）：n=16）。d MG2中记录到的对9-ODA的气味诱发反应（ΔF/F[%]）的平均时间过程（秒，x轴）。fruP1^-：n=10。野生型雄蜂：n=16。蓝条：气味呈现。钙信号显示双相反应，气味呈现时荧光增加。呈现平均值及均值标准误（SEM）。e整个AL中对3种气味剂（1-6ol、IPA和苯甲醛）的钙反应幅度（ΔF/F[%]）。显示中位数（中间线）和四分位数。fruP1^-和野生型雄蜂之间的反应未发现差异（基因型效应：P=0.49，F1,25=0.48，双向重复测量方差分析。Air：空气对照）。与空气对照相比，所有气味剂均诱导了显著活性（气味效应：P<0.0001，Tukey事后检验）。fruP1^-（红色）：n=11。野生型（蓝色）：n=16。所有统计检验均为双侧。'>

通过体内钙成像技术记录触角叶对信息素和普通气味剂的神经活动，发现fruP1突变体在巨小球形结构MG2中对9-ODA的反应强度、反应模式和时间过程与野生型无差异，对其他气味剂的处理也正常。这表明初级嗅觉处理功能完好，行为缺陷可能源于更高级的神经整合中心。

研究结论与意义

这项研究首次确定了编程蜜蜂雄性合作行为的关键基因fru，揭示了Fru^M转录因子通过特定神经环路控制社会性行为启动和维持的机制。研究发现Fru^M并不影响化学感受受体库、神经纤维网宏观结构或初级嗅觉处理，而是可能通过调节更高级神经中心的连接性或功能特性来指定行为。

尤为重要的是，该研究提出了合作行为组织的新机制：个体参与社会性任务（如交哺）的速率和持续时间是先天编程的，这种编程通过Fru^M实现，从而在个体水平"定量调节"其对群体任务的参与程度。这种先天性的参与尺度调节将局部刺激遭遇和个体任务决策与群体水平的合作表现联系起来，为理解社会性昆虫的行为组织提供了新视角。

从进化角度看，蜜蜂的fru基因在保留其祖先功能（硬连线交配行为）的同时，获得了新的功能（编程蜂群内合作行为）。与独居的果蝇相比，蜜蜂雄性中脑表达Fru^M的细胞数量（约1800个）惊人地保守，但环路连接和功能特性发生了显著分化，特别是Fru^M不在嗅觉感觉神经元中表达，也不控制触角叶性别二态性结构的发育。这表明社会性行为的进化可能更多通过改变现有基因产物的环路连接性和功能实现，而非单纯增加神经元数量。

这项研究为在神经系统水平上剖析社会性行为的控制和进化机制提供了重要基础，Fru^M+环路作为模型系统，为理解合作行为的神经遗传机制开辟了新途径。