痘苗病毒mRNA 5'-poly(A)前导序列长度与m7G帽结构缺失的负相关性研究及其在转录后调控中的意义

《Nature Communications》：Vaccinia virus mRNAs containing long 5′-poly(A)-leaders lack a canonical 5′-methylguanosine cap

本研究针对痘苗病毒（VACV）mRNA 5'端帽结构存在与否的争议，通过改良的5' RACE技术首次在单分子水平证实：携带长非模板5' poly(A)前导序列的VACV中间期和晚期mRNA普遍缺失m7G帽结构，且帽出现概率与前导序列长度呈负相关（Pearson r=-0.72）。该发现揭示了VACV通过启动子区INR序列介导的RNA聚合酶滑移机制调控mRNA加帽效率，为理解病毒劫持宿主翻译机器提供了新视角。

　　

在病毒与宿主的永恒军备竞赛中，痘苗病毒（Vaccinia virus, VACV）作为根除天花的功臣，曾为人类揭示真核生物mRNA 5'端帽结构（m⁷G cap）的奥秘立下汗马功劳。半个世纪以来，科学界普遍认为VACV的所有mRNA均携带这一标志性结构。然而，随着对病毒转录调控机制的深入探索，研究者发现VACV的中间期和晚期mRNA的5'端常伴随长非模板poly(A)前导序列，这些序列如何影响帽结构合成成为悬而未决的关键问题。

传统认知正面临挑战：当病毒进入复制后期，其mRNA是否需要依赖帽结构进行翻译？近年研究发现，VACV可通过磷酸化RACK1等宿主因子重编程核糖体，暗示晚期mRNA可能存在帽非依赖性翻译机制。更引人注目的是，与VACV同源的酵母病毒样元件（Virus-like elements, VLEs）的mRNA已被证实存在5'端poly(A)前导序列且缺乏帽结构。这些线索促使研究人员重新审视VACV mRNA的5'端修饰真相。

为破解这一谜题，捷克查尔斯大学的研究团队开发了高精度单分子分析技术，对VACV不同基因时相（gene time classes, GTCs）的mRNA进行系统性检测。结果令人震惊：超过90%的晚期VACV mRNA竟然缺失m⁷G帽结构！这一发现发表于《Nature Communications》的研究不仅颠覆了持续四十年的认知，更揭示了病毒通过精细调控转录起始过程实现翻译策略转换的新机制。

研究团队主要运用了以下关键技术：改良型5' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）单分子测序法，可特异性识别m⁷G帽结构；RNA连接酶介导的cDNA末端扩增（RLM-RACE）用于富集帽化转录本；RNA 5'多磷酸酶/核酸外切酶联合处理验证5'端修饰状态；基于痘苗病毒WR株及D9/D10脱帽酶双突变体（vD9muD10mu）的感染模型（使用HeLa和BHK-21细胞系）；以及包含INR点突变（TAACAT）的EGFP报告系统验证启动子功能。

结果1：5' RACE揭示VACV mRNA帽结构分布规律

通过分析306个单分子cDNA序列，发现早期启动子不含INR的基因（如J6R）mRNA全部加帽且无poly(A)前导序列；而含INR的早期基因（如A5R）仅50%加帽。中间期基因帽化率降至11%-36%，晚期基因（如A17L）帽化率几乎为零。所有未加帽mRNA均携带非模板poly(A)前导序列。

结果2：5' poly(A)前导序列长度与GTCs的关联

对219个含INR启动子的转录本分析显示，晚期基因poly(A)前导序列长度中位数（20 nt）显著长于早期基因（p_adj<0.0001），符合病毒通过延长前导序列抑制加帽的调控策略。

结果3：帽结构与poly(A)长度的负相关性

当5'端非模板腺苷数≥6时，帽化率骤降至4%。统计学分析证实二者呈显著负相关（Pearson r=-0.72, p=0.003），提示长poly(A)前导序列直接阻碍加帽酶作用。

结果4：帽化与未帽化转录本的前导序列长度差异

通过RLM-RACE富集稀有帽化晚期mRNA，发现C3L基因帽化转录本的poly(A)前导序列长度显著短于未帽化版本（p=0.00096），证明加帽效率受前导序列长度直接调控。

结果5：INR突变对加帽及poly(A)形成的影响

将G8R启动子INR由TAAAAT突变为TAACAT后，poly(A)前导序列形成率从83.3%降至31.6%，帽化率则从20.8%升至57.9%，证实完整INR寡腺苷序列是产生未帽化mRNA的必要条件。

结果6：脱帽酶D9/D10的非必要性

比较WR野生型与vD9muD10mu双突变病毒感染的mRNA，发现帽化率和poly(A)长度无显著差异，表明未帽化mRNA的产生不依赖病毒脱帽酶活性，而是转录起始固有特性。

本研究通过多维度实验证实：VACV利用INR介导的RNA聚合酶转录起始滑移机制合成5' poly(A)前导序列，其长度直接决定m⁷G帽结构的合成效率。这种转录与加帽的耦合调控使病毒在感染后期实现从帽依赖性向帽非依赖性翻译的战略转换，可能通过降低宿主竞争性mRNA的翻译效率而获得生存优势。该机制在VLEs中的保守存在提示其为古老病毒进化策略，对理解痘病毒（如猴痘病毒）的致病机制及开发靶向转录调控的抗病毒策略具有重要启示。