跨平台临床蛋白质组学新标准：Charité开放血浆肽段标准品(OSPP)提升定量重现性与疾病标志物发现

《Nature Communications》：Cross-platform clinical proteomics using the Charité open standard for plasma proteomics (OSPP)

本文推荐介绍研究人员针对血浆蛋白质组学中定量准确性、重现性和跨平台可比性等挑战，开发了名为Charité开放血浆肽段标准品(OSPP)的211重稳定同位素标记肽段标准品。该研究通过大规模数据集筛选出性能稳定的肽段，验证其在多种血液基质和质谱平台上的优异表现，并在COVID-19队列中证实其可显著提高疾病分层和生物标志物发现的可靠性，为临床蛋白质组学的标准化提供了重要工具。

　　

在生物医学研究领域，血浆和血清蛋白质组分析正变得越来越重要，因为通过简单的血液采样就能获取反映人体生理和病理状态的丰富信息。液体色谱-质谱联用(LC-MS)技术能够同时定量分析大量蛋白质，且成本相对较低，已成为蛋白质组学研究的主力军。然而，该技术在临床常规应用仍面临诸多挑战：不同实验室、不同仪器平台、不同分析方法得到的数据往往难以直接比较，这种"巴别塔"式的数据鸿沟严重阻碍了蛋白质组学在临床诊断和生物标志物发现中的应用。

面对这一困境，稳定同位素标记内标(SIL-IS)技术应运而生。这类标准品如同蛋白质组学分析中的"尺子"，能够对实验过程中的技术变异进行校正和标准化。尽管市场上已有一些商业化的肽段标准品，但它们在使用成本、检测稳定性以及跨平台性能方面仍有优化空间。更重要的是，现有标准品往往缺乏针对临床血浆样本的特异性优化设计。

在这一背景下，Charité-Universit?tsmedizin Berlin的Markus Ralser和Michael Mülleder领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为Charité开放血浆肽段标准品(OSPP)的新型肽段内标，专门为解决临床血浆蛋白质组学中的标准化难题而设计。

研究人员开展这项研究的关键技术方法包括：基于超过15,000例人血浆和血清样本的大规模蛋白质组数据集进行肽段筛选；采用稳定同位素标记肽段的合成与验证技术；在COVID-19患者队列（包含45名从未感染到危重症的患者）中进行方法验证；使用包括ZenoTOF 7600、timsTOF HT和Orbitrap Exploris 480在内的多种LC-MS平台进行跨平台性能评估；应用数据非依赖采集(DIA)和数据依赖采集(DDA)等多种质谱采集方法进行比较研究。

选择具有分析稳健性的肽段标准品来自大规模蛋白质组数据集

研究团队首先挖掘了来自Charité高通量质谱核心设施2020-2022年间的宝贵数据资源，这些数据包括1,505次对照注射分析，涵盖了15,617个血浆和血清蛋白质组的分析结果。通过引入相对排名指标，团队从大量候选肽段中系统筛选出那些在不同研究、不同样本基质中都能被稳定检测和定量的肽段。

筛选过程极其严格：首先要求肽段在至少一半的研究项目中都能被检测到，且至少在两种血液基质（如血清、EDTA血浆、枸橼酸盐血浆或肝素血浆）中存在；其次，每个蛋白最多选择三个表现最佳的肽段，以确保覆盖更宽的蛋白浓度动态范围；最后，还考虑了肽段的化学物理性质，如长度在6-25个氨基酸之间、避免易发生化学修饰的位点等。通过这一精心设计的筛选流程，团队最终确定了187个新肽段，并结合之前研究中表现优异的24个肽段，构成了包含211个肽段的OSPP标准品。

评估所选肽段标准品

合成验证后的OSPP肽段显示出理想的色谱行为，在20分钟微流液相色谱梯度中呈现出均匀的保留时间分布。更重要的是，这些肽段在肝素、枸橼酸盐、EDTA血浆以及血清等多种血液基质中均表现出稳定的检测性能，93%的肽段在超过66%的样本中都能被一致检测到。

研究团队还创新性地将OSPP中每个肽段的浓度调整到与其内源性对应物相近的水平，创建了浓度匹配的内标。这种设计不仅提高了定量准确性，还显著降低了合成成本，因为低丰度肽段只需要合成少量即可。与商业标准品PQ500的比较显示，OSPP在检测稳定性和定量精度方面均优于后者，尽管PQ500包含更多肽段（804个），但只有43%能在实验设置中被稳定检测，而OSPP的检测率高达98%。

评估OSPP在SARS-CoV-2感染人体宿主反应案例研究中的应用

为验证OSPP的实际应用价值，研究团队在一个精心设计的COVID-19临床队列中进行了测试。该队列包含从未感染到危重症的不同疾病严重程度患者，为评估肽段标准品在疾病生物标志物发现中的效用提供了理想平台。

研究结果显示，使用OSPP作为内标进行标准化后，数据分析的精确度和可靠性显著提高。技术偏差和噪音得到更好控制，使得更多与疾病严重程度相关的肽段变化被检测出来：使用OSPP标准化后，额外34个肽段显示出与疾病严重程度的显著关联，而仅有两个之前显著的关联失去显著性（可能是由于方法不精确导致的假阳性）。最终，超过三分之二的肽段（138/202）显示与COVID-19严重程度相关的定量变化。

主成分分析显示，经过OSPP标准化后的肽段定量数据能够清晰区分不同治疗升级水平的患者。值得注意的是，许多被检测到的变化肽段与COVID-19的病理生理过程密切相关，如来源于四连蛋白(CLEC3B)的肽段在重症COVID-19中显著降低，而补体因子C3来源的肽段则随严重程度增加而升高。

应用OSPP进行人血浆中的跨方法蛋白质组分析

研究团队进一步比较了OSPP在靶向（Zeno MRM-HR）和非靶向（Zeno SWATH DIA）采集方法中的定量性能。结果显示，两种方法在肽段和碎片离子水平均表现出高度一致性。更重要的是，使用OSPP作为内标进行标准化后，两种方法间的定量相关性从0.39（中位数标准化）显著提高至0.83（OSPP比值标准化），表明OSPP能够有效校正不同采集方法间的技术差异。

以载脂蛋白A-II(APOA2)来源的肽段SPELQAEAK为例，使用OSPP标准化后，其在靶向和非靶向方法中的定量相关性从0.49提升至0.98。这种一致性的提高使得更多蛋白质能够被可靠地与疾病严重程度关联起来，如APOA2在COVID-19患者中的失调变化，反映了脂质代谢和宿主炎症反应的改变。

在不同DIA-MS平台上获取的血浆蛋白质组数据比较中使用OSPP

跨平台可比性是临床蛋白质组学面临的主要挑战之一。研究团队将评估扩展到多种LC-MS配置，涵盖从纳流色谱（250 nl/min）到用于高通量应用的分析流率色谱（800 μl/min），这些液相系统与不同的质谱仪（Orbitrap Exploris 480和ZenoTOF 7600）联用。

在所有平台上，211个OSPP内标肽段中有187对（88.6%）内源性肽段及其对应的SIL-IS肽段能够在超过三分之二的样本中被一致鉴定和定量。主成分分析显示，经过OSPP标准化后，数据呈现出强大的跨平台一致性，第一主成分（22.7%）对应于疾病严重程度相关的主要变异，而技术平台间的差异仅解释了一小部分变异。

为突显使用OSPP内标进行跨平台数据对齐的可能性，研究团队创建了一个人工"复合数据集"，其中肽段定量随机取自不同平台获取的数据集（OSPP标准化后）。与单一平台数据集相比，复合数据集在检测疾病相关肽段变化方面表现出高度一致性，如APOA2来源的肽段在COVID-19进展中的浓度变化趋势在两种数据集中均得到确认。

研究结论与意义

Charité开放血浆肽段标准品(OSPP)的研究代表了临床蛋白质组学标准化的重要进展。尽管OSPP肽段是出于纯技术原因筛选的，但它们源自功能重要的血浆蛋白，参与代谢和营养运输、先天和适应性免疫系统以及凝血系统等多种生物过程。这些蛋白对多种疾病有响应，包含许多已确立的临床生物标志物和/或FDA批准的药物靶点，因此OSPP也能直接监测许多疾病过程，而无需扩展疾病特异性标志物。

作为疾病无关的内标，OSPP的设计初衷不是作为临床标志物panel，而是为了适应和改进各种血液蛋白质组学研究的数据质量。其开放性设计允许用户将其用于不同的血液研究，并添加更多疾病特异性肽段。理论上，OSPP也可以与其他SIL-IS panel（如PQ500）整合，进行更广泛的分析。

研究人员也坦诚指出了OSPP的局限性，例如所有用于肽段选择的数据都是使用同一质谱平台获取的，这意味着在该选择平台上检测不佳的肽段在OSPP标准品中是缺失的。未来的挑战包括实现在单个DIA实验中同时进行基于内标的绝对定量和基于发现的蛋白质组学分析。

尽管存在这些挑战，OSPP作为一个强大且开放可及的肽段内标，为提高血浆和血清蛋白质组学研究的重现性和跨平台定量对齐提供了有效工具。通过从大型蛋白质组数据集中筛选具有理想特性的肽段，OSPP肽段与内源性肽段浓度匹配，并且在各种采集方法和平台中都能被稳定检测。其开放性设计使研究人员能够从任何肽段生物合成提供商订购部分或全部肽段，允许在内部创建具有高成本效益的内标。研究表明，OSPP不仅允许针对疾病特异性标志物panel进行定制，还提供了一个强大、可重现的平台，本身就能捕获关键血浆蛋白和FDA批准的药物panel，证明了其在严重COVID-19定量蛋白质组学和患者分层中的实用性。