胆固醇偶联PMO/RNA异源双链寡核苷酸：一种用于中枢神经系统的高效、持久且安全的空间位阻反义寡核苷酸新平台

《Nature Communications》：Morpholino–RNA duplex exhibits robust, sustained, and safe steric-block antisense activity by intracerebroventricular and intrathecal injection

本研究针对传统反义寡核苷酸（ASO）在中枢神经系统（CNS）递送中存在的毒性、效力不足及作用持久性差等难题，开发了一种胆固醇偶联的PMO/RNA异源双链寡核苷酸（Chol-HDO[PMO]）。该技术通过利用脑脊液（CSF）中的脂蛋白作为天然递送载体，显著增强了PMO的组织递送效率，在杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠模型中实现了高达16倍的效力提升，并展现出优异的持续作用时间与安全性。该研究为开发靶向CNS的下一代反义寡核苷酸疗法提供了新策略。

　　

在神经科学和基因治疗领域，反义寡核苷酸（ASO）正成为治疗遗传性神经系统疾病的有力武器。通过鞘内（IT）或脑室内（ICV）注射，ASO可以直接靶向中枢神经系统（CNS）中的致病基因。其中，空间位阻ASO（Steric-block ASO）能够在不切割RNA的情况下，通过物理阻断来调控RNA的剪接或翻译过程，为纠正由剪接缺陷引起的疾病提供了希望。

然而，目前临床应用的ASO化学骨架主要分为两类，各有其局限性。一类是带有硫代磷酸酯（PS）骨架和2'-O-甲氧乙基（MOE）修饰的ASO，虽然其组织分布和效力较好，但PS骨架的非特异性蛋白结合特性常常导致血小板减少和肾毒性等副作用。另一类是磷酰二胺吗啉代寡聚体（PMO），其不带电荷的骨架赋予了其极佳的安全性，但同时也导致了细胞摄取效率低、组织分布差以及作用持续时间短的问题，这极大地限制了其在CNS中的应用。

因此，开发一种兼具PMO的安全性与MOE的高效性，且作用持久的ASO递送平台，是推动CNS靶向治疗发展的关键。

为了攻克这一难题，来自东京医科齿科大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们巧妙地将PMO与异源双链寡核苷酸（HDO）技术相结合，开发了一种名为胆固醇偶联PMO/RNA异源双链寡核苷酸（Chol-HDO[PMO]）的新平台。该技术通过利用脑脊液中的天然脂蛋白作为“特洛伊木马”，成功地将PMO高效递送至CNS组织，实现了效力、持久性和安全性的三重飞跃。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   寡核苷酸设计与合成：合成了靶向小鼠Dmd基因和人SOD1基因的25-mer单链PMO（ssPMO）和MOE（ssMOE），以及相应的胆固醇偶联互补RNA链，通过杂交形成Chol-HDO。
2. 2.
   动物模型与给药：使用杜氏肌营养不良症（DMD）模型小鼠（mdx小鼠）和家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型小鼠（SOD1 G93A转基因小鼠），通过脑室内（ICV）或鞘内（IT）注射给药。
3. 3.
   药效学与药代动力学评估：通过RT-PCR和Western blotting检测Dmd基因外显子23跳跃率和SOD1蛋白表达水平；利用杂交ELISA和原位杂交（ISH）技术检测ASO在组织中的分布与浓度。
4. 4.
   行为学与安全性评价：通过旷场实验评估小鼠的恐惧反应和运动能力；通过qRT-PCR检测炎症因子表达，并监测体重变化，全面评估Chol-HDO的神经毒性和免疫原性。
5. 5.
   机制探究：利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）和质谱分析，鉴定与Chol-HDO结合的脑脊液蛋白；通过注射LDLR家族拮抗剂（RAP），验证脂蛋白受体介导的递送机制。

研究结果

Chol-HDO[PMO]显著增强剪接调控效力

研究人员首先在mdx小鼠模型中评估了Chol-HDO[PMO]的剪接调控能力。结果显示，单次ICV注射后，Chol-HDO[PMO]诱导的外显子23跳跃率远高于单链PMO（ssPMO）和单链MOE（ssMOE），效力提升了5.3至16.1倍。值得注意的是，Chol-HDO[MOE]并未表现出类似的效力增强，表明其活性高度依赖于反义链的化学骨架。

Chol-HDO[PMO]实现高效组织递送

为了解释效力增强的原因，研究人员检测了ASO在组织中的分布。结果显示，Chol-HDO[PMO]注射后，组织中ssPMO的积累量比ssPMO注射组高出5.7倍以上。而Chol-HDO[MOE]注射后，组织中ssMOE的积累量与ssMOE注射组相当。原位杂交结果进一步证实，Chol-HDO[PMO]能够将ssPMO广泛递送至CNS实质中。

Chol-HDO[PMO]展现出持久且广泛的药效

在时间进程分析中，单次ICV注射Chol-HDO[PMO]后，其诱导的外显子跳跃活性在9周内持续存在，且效力超过了ssMOE。在大鼠鞘内注射实验中，Chol-HDO[PMO]同样在包括纹状体在内的多个CNS区域诱导了显著的剪接调控，且在外周器官（如肝脏和肾脏）中几乎检测不到活性，显示出良好的CNS靶向性。

Chol-HDO[PMO]有效改善DMD小鼠的CNS表型

免疫荧光分析证实，Chol-HDO[PMO]处理显著恢复了mdx小鼠海马和杏仁核中肌营养不良蛋白（Dp427）的表达，且该蛋白与GABA_A受体共定位，表明其功能得到恢复。行为学实验显示，Chol-HDO[PMO]治疗显著改善了mdx小鼠因短暂束缚诱导的恐惧反应，表现为僵直时间减少、总移动距离和垂直活动增加。

Chol-HDO[PMO]在翻译抑制中同样有效且更安全

研究人员进一步评估了Chol-HDO[PMO]在翻译抑制方面的应用。在SOD1 G93A转基因小鼠中，Chol-HDO[PMO]能够有效降低人SOD1蛋白水平，而ssPMO则无效。值得注意的是，高剂量的ssMOE在ICV注射后表现出致死性毒性，而Chol-HDO[PMO]在所有剂量下均表现出良好的耐受性。

Chol-HDO[PMO]具有优异的安全性

安全性评估显示，Chol-HDO[PMO]在急性神经毒性、免疫刺激反应和晚期毒性（如体重减轻）方面均表现出良好的安全性，显著优于传统的PS-MOE ASO。

Chol-HDO[PMO]通过结合CSF脂蛋白实现高效递送

机制研究表明，Chol-HDO[PMO]能够与脑脊液中的脂蛋白（特别是载脂蛋白E，ApoE）形成稳定的复合物，而Chol-HDO[MOE]则不能。当使用LDLR家族拮抗剂（RAP）阻断脂蛋白受体后，Chol-HDO[PMO]的药效显著降低，证实了其通过脂蛋白-LDLR家族相互作用介导的递送机制。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种名为Chol-HDO[PMO]的新型反义寡核苷酸递送平台。该平台通过将PMO与胆固醇偶联的RNA互补链杂交，巧妙地利用了脑脊液中的内源性脂蛋白作为天然递送载体，实现了PMO在中枢神经系统中的高效、持久且安全的递送。

该研究具有以下重要意义：

1. 1.
   突破递送瓶颈：解决了PMO因细胞摄取效率低而导致的效力不足问题，使其效力提升了16倍，并展现出持久的药效。
2. 2.
   实现双重功能：不仅适用于剪接调控，也适用于翻译抑制，拓展了空间位阻ASO的应用范围。
3. 3.
   提供安全新策略：通过利用PMO的安全骨架和低PS修饰的HDO结构，避免了传统PS-MOE ASO的毒性问题，为开发更安全的CNS靶向药物提供了新思路。
4. 4.
   揭示新机制：阐明了Chol-HDO[PMO]通过结合脑脊液脂蛋白并利用受体介导的内吞作用进入细胞的递送机制，为理解寡核苷酸在CNS中的分布提供了新的见解。

总之，Chol-HDO[PMO]作为一种高效、持久且安全的平台技术，有望极大地扩展空间位阻反义寡核苷酸在中枢神经系统疾病治疗中的应用潜力，为杜氏肌营养不良症、肌萎缩侧索硬化症等难治性神经系统疾病带来新的希望。