靶向丝氨酸蛋白酶TMPRSS2抑制鸡细胞和器官培养物中甲型流感病毒复制的研究

《Heliyon》：Restriction of influenza A virus replication via serine protease targeting in chicken cells and organ cultures

本研究针对禽流感病毒(AIV)持续威胁动物福利和家禽业的问题，探讨了通过靶向宿主丝氨酸蛋白酶TMPRSS2来限制病毒复制的新策略。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了TMPRSS2基因敲除(KO)的鸡DF-1细胞系，并结合气管器官培养(TOCs)和肺组织培养(LCs)模型，评估了蛋白酶抑制剂Camostat mesylate(CAM)对低致病性禽流感病毒(LPAIVs)H9N2和H6N8复制的抑制作用。结果表明，基因敲除和化学抑制均能显著降低病毒复制，并延长感染后器官培养物的纤毛活性和存活时间。这为开发针对禽流感的新型抗病毒疗法提供了重要理论依据，同时证实了鸡器官培养系统在药物评价中的应用价值。

　　

禽流感病毒(AIV)一直是悬在全球家禽业和公共卫生头上的达摩克利斯之剑。近年来，高致病性禽流感病毒(HPAIVs)H5N1的泛流行事件更是敲响了警钟，导致数百万只鸟类死亡或被扑杀，甚至跨越物种屏障感染了包括牛在内的多种哺乳动物。与此同时，高致病性和低致病性禽流感病毒(LPAIVs)的全球传播和重配以惊人的速度进行着，这迫切要求我们探索不同的方法来限制病毒复制和预防感染。

鸡作为禽流感病毒的自然宿主，不仅是研究病毒与宿主相互作用的独特模型，更是人类饮食中动物蛋白的重要来源。尽管实施了严格的生物安全措施，禽流感疫情的暴发仍持续给家禽业造成巨大的经济损失。因此，深入理解病毒与宿主的相互作用，对于开发实用且可持续的干预解决方案至关重要。

一个充满前景的策略是靶向宿主的丝氨酸蛋白酶，抑制病毒血凝素(HA)的翻译后修饰。HA是流感病毒表面的关键蛋白，其合成初期是前体蛋白HA0，必须被宿主蛋白酶切割成HA1和HA2两个亚基，病毒才能成功侵入细胞。LPAIVs的HA具有单碱性切割位点，需要胰蛋白酶样蛋白酶（如跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)）进行切割。而HPAIVs则具有多碱性切割位点，可被普遍存在的弗林蛋白酶等切割。研究表明，缺乏功能性TMPRSS2的小鼠并未表现出病理表型，但在流感感染后，其病毒复制水平更低，存活率更高。此外，丝氨酸蛋白酶的化学抑制剂也被证明能在哺乳动物模型中减少流感病毒的复制。

然而，与哺乳动物相比，我们对鸡TMPRSS2的了解十分有限。先前的研究主要集中在哺乳动物TMPRSS2抑制流感病毒复制的作用上，关于鸡TMPRSS2的信息却很少。为了解决这一问题，并探索在禽类中限制流感病毒复制的新方法，研究人员在《Heliyon》上发表了一项研究，他们利用两种鸡器官培养系统——气管器官培养(TOCs)和肺组织培养(LCs)，以及通过CRISPR/Cas9技术构建的TMPRSS2基因敲除鸡DF-1细胞，深入探究了靶向鸡TMPRSS2及相关蛋白酶对甲型流感病毒(IAV)复制的抑制作用。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了几个关键技术方法：首先，他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了缺失TMPRSS2丝氨酸蛋白酶结构域的鸡DF-1细胞敲除株，为在细胞水平研究该蛋白酶的功能提供了工具。其次，他们建立了鸡胚胎气管器官培养和肺组织培养模型，这些离体模型能够较好地模拟呼吸道环境，用于评估药物效果，符合动物实验的3R原则。再者，研究使用了蛋白酶抑制剂Camostat mesylate进行化学抑制实验。在病毒感染实验中，研究人员特别制备了HA未切割(HA0)的病毒株，以便更准确地评估宿主蛋白酶在病毒复制初始阶段的作用。病毒滴度的测定则通过免疫荧光检测NP蛋白来实现。此外，还通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色和活/死细胞染色等技术对基因表达、蛋白切割、病毒感染情况和细胞活性进行了综合分析。

2.1. TMPRSS2 KO DF-1细胞的构建及其对IAVs的易感性

研究人员首先致力于构建一个可用于研究病毒-宿主相互作用中鸡蛋白酶的细胞系。他们利用CRISPR/Cas9系统，成功构建了一个克隆性的TMPRSS2^-/-DF-1细胞系，该细胞系的TMPRSS2基因缺失了蛋白酶结构域，形成了一个截短版本的TMPRSS2蛋白（图1A）。Sanger测序证实了TMPRSS2丝氨酸蛋白酶结构域的成功敲除。通过用H1N1-HA0病毒感染DF-1野生型(WT)细胞、CAM处理的DF-1细胞(CAM-DF-1)和TMPRSS2^-/-细胞，评估了TMPRSS2敲除或丝氨酸蛋白酶抑制剂处理对病毒复制的影响。结果显示，与WT细胞相比，CAM-DF-1和TMPRSS2^-/-DF-1细胞中的病毒滴度显著降低(p < 0.05)（图1C），这表明蛋白酶抑制或缺失对DF-1细胞中的IAV复制具有限制作用。RT-PCR表达分析显示，与WT细胞相比，TMPRSS2-KO DF-1细胞中无TMPRSS2表达（图1B）。

-/- DF-1细胞的感染实验表明，与DF-1 WT细胞相比，CAM-DF-1和TMPRSS2^-/-细胞中H1N1-HA0的复制显著降低(p < 0.05)(MOI 0.1)。 D. 感染H9N2-HA0和H9N2-cHA(10⁵FFU/TOC)后24小时和48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的病毒滴度(p < 0.05)。 E. 感染H6N8-HA0和H6N8-cHA(10⁵FFU/TOC)后24小时和48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的病毒滴度(p < 0.05)。'>

2.2. TMPRSS2在不同鸡细胞和器官中的表达

研究人员评估了chTMPRSS2在不同细胞类型和组织中的表达，包括鸡DF-1细胞、鸡胚成纤维细胞(CEFs)、PGC来源的成纤维细胞(PGC-Fs)、胸肌、气管和肺组织。肺和气管中的表达水平高于其他组织和细胞。因此，他们使用器官培养物并检验了它们在AIV背景下评估蛋白酶抑制剂的适用性。

2.3. 用蛋白酶抑制剂处理器官培养物可防止IAV感染导致的纤毛活动丧失

在TOCs中，抑肽素(Aprotinin)和CAM对未感染(NIF-)TOCs的纤毛活动没有显示出不利影响，与未处理的(UNT-)NIF-TOCs相比未检测到显著差异(p > 0.05)。相反，用H1N1感染器官培养物效率低下，因此研究人员没有继续这些实验。他们首先测试了两种丝氨酸蛋白酶抑制剂CAM和抑肽素在H9N2-HA0感染期间的作用（图2A）。在感染后38小时(hpi)，CAM-TOCs的纤毛活动度为72%，而UNT-TOCs的纤毛活动度显著较低，为6%(p < 0.05)。在48 hpi时，UNT-TOCs未表现出任何纤毛活动，而CAM-TOCs的纤毛活动度为43%（图2A）。UNT-TOCs与抑肽素处理的TOCs(A-TOCs)之间，或CAM-TOCs与抑肽素和CAM联合处理的TOCs(ACAM-TOCs)之间的纤毛活动度没有显著差异(p > 0.05)。基于这些数据，后续实验仅使用CAM，因为该抑制剂单独使用对AIV感染具有保护作用。在下一个实验中，TOCs用H9N2-cHA感染（图2B）。CAM-TOCs在38 hpi时显示出66%的纤毛活动度，在48 hpi时降至46%。相反，UNT-TOCs在38 hpi时的活动度为9%，在48 hpi时完全丧失纤毛活动。从38 hpi开始，检测到UNT-TOCs的纤毛活动度与CAM-TOCs相比存在显著差异(p < 0.05)（图2B）。

研究人员进一步检测了H6N8感染后AIV感染对纤毛活动的影响。用H6N8-HA0感染TOCs，在38 hpi时，与CAM-TOCs相比，UNT-TOCs的纤毛活动度显著降低(p < 0.05)。UNT-TOCs在38 hpi时的纤毛活动度为18%，在48 hpi时为0.7%。相比之下，CAM-TOCs在38 hpi和48 hpi分别保持了81%和80%的活动度（图2C）。用H6N8-cHA感染TOCs导致CAM-TOCs在24 hpi时的纤毛活动度为74%，在48 hpi时为69%。另一方面，UNT-TOCs在24 hpi时的纤毛活动度为52%，在48 hpi时为6%（图2D）。他们检测到两组之间从24 hpi开始就存在显著差异(p < 0.05)。

5 FFU/TOC)后0至48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的纤毛活动度(p < 0.05)。 B. 感染H9N2-cHA(10⁵FFU/TOC)后0至48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的纤毛活动度(p < 0.05)。 C. 感染H6N8-HA0(10⁵FFU/TOC)后0至48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的纤毛活动度(p < 0.05)。 D. 感染H6N8-cHA(10⁵FFU/TOC)后0至48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs的纤毛活动度(p < 0.05)。 E. 感染H9N2-HA0 24小时后，未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs中NP2蛋白的免疫荧光染色。 F. 感染H6N8-HA0的未处理(UNT-)和CAM处理的TOCs中NP2蛋白的免疫荧光染色；TOCs针对病毒NP2蛋白（德克萨斯红，红色）和细胞核（DAPI，蓝色）进行染色。'>

2.4. CAM处理显著降低TOCs中H9N2和H6N8的病毒滴度

研究人员评估了蛋白酶抑制后TOCs中产生的病毒颗粒数量。蛋白酶抑制剂CAM导致TOCs中病毒复制的减少。在H9N2-HA0感染的情况下，UNT-TOCs的病毒滴度在24 hpi时显著高于CAM-TOCs，而在48 hpi时两组之间未检测到显著差异(p < 0.05)（图1D）。这些结果通过24和48 hpi的免疫荧光染色得到证实（图2E）。此外，H9N2-cHA的复制在24 hpi和48 hpi时，UNT-TOCs中均显著高于CAM-TOCs(p < 0.05)（图1D）。CAM处理也限制了H6N8-HA0和H6N8-cHA的复制。UNT-TOCs中的H6N8复制在24 hpi和48 hpi时均显著高于(p < 0.05) CAM-TOCs中的复制（图1E）。这些结果进一步通过24 hpi和48 hpi的免疫荧光染色得到证实（图2F）。

2.5. CAM处理显著降低LCs中H9N2的病毒滴度

为了研究在肺部进行蛋白酶抑制的可能性，研究人员按照先前描述的方法从鸡胚胎中分离了LCs，并进行了轻微修改。基于从TOCs感染获得的数据，他们决定用CAM处理LCs，随后用具有预切割HA的H9N2感染它们。CAM处理对LCs的存活没有负面影响，未感染的未处理(NIF-UNT-)LCs和未感染的CAM处理(NIF-CAM-)LCs的FDA/PI染色结果显示了这一点。结果表明，在24和48 hpi收集的上清液中病毒滴度显著降低(p < 0.05)（图3A）。这些结果也通过24 hpi的免疫荧光染色得到证实（图3D和E）。此外，他们在48 hpi时使用活/死染色监测了CAM处理和未处理(UNT-)LCs中上皮层的活力。他们发现H9N2感染导致UNT-LCs（图3B）中的红色染色比CAM-LCs（图3C）增加。

5 FFU/LC)后24和48小时，未处理(UNT-)和CAM处理的LCs的病毒滴度(p < 0.05)，与UNT-LCs相比，CAM-LCs中的病毒复制在24和48 hpi时显著降低； B. 未处理的肺组织培养(UNT-LC)和CAM处理的肺组织培养(CAM-LC)的活/死染色； C. 两者均在感染H9N2-cHA(10⁵FFU/LC)后48小时采集；活细胞用荧光素二乙酸酯(FDA)染色，而死细胞用碘化丙啶(PI)染色。黑色箭头指示死亡的上皮细胞，而白色箭头显示存活的上皮细胞。 D. 感染H9N2的未处理肺组织培养(UNT-LC)中病毒NP2蛋白的免疫荧光染色，24 hpi(10⁵FFU/LC)和(E) 感染H9N2(10⁵FFU/LC)后48小时，CAM处理的肺组织培养中病毒NP2蛋白的免疫荧光染色； LCs针对病毒NP2蛋白（德克萨斯红，红色）和细胞核（DAPI，蓝色）进行染色。'>

3. 讨论与结论

禽流感对动物福利和家禽业的持续威胁要求我们不断进行研究以减轻其影响。本研究通过基因修饰靶向TMPRSS2或使用蛋白酶抑制剂处理，分别评估了蛋白酶抑制对鸡细胞和器官培养物中IAV复制的影响。研究数据表明，鸡TMPRSS2相关蛋白酶在禽流感病毒的感染性中起着至关重要的作用。这在TOCs和LCs中使用化学抑制得到了证明，这些器官培养物被证实是在AIVs背景下评估抑制剂的合适工具。

关于HA切割，研究人员在MDCK细胞中产生了HA0病毒，并通过Western blot确认。与一些研究认为TMPRSS2在细胞表面切割HA0的观点不同，本研究的结果支持TMPRSS2更可能在病毒复制期间，在内质网和宿主细胞质膜之间切割HA0的观点。对细胞水平HA切割的Western blot分析显示，感染的WT-DF-1、CAM-DF-1和TMPRSS2-KO细胞产生了相似水平的切割蛋白HA1和HA2。在初始感染HA0病毒后，病毒侵入细胞的延迟可以解释切割率无差异但病毒复制率有差异的现象，之后其他蛋白酶可能补偿了TMPRSS2的缺失。

在TOCs中，研究人员比较了抑肽素和CAM两种处理。与使用人气道上皮细胞和鸡胚的研究不同，抑肽素未能预防TOCs中的纤毛停滞，也未限制LPAIV H9N2的复制，这与CAM在抑制IAV方面比抑肽素更有效的报道一致。然而，抑肽素与CAM在低剂量下协同抑制了IAV诱导的纤毛停滞，证明了在上呼吸道联合使用抗病毒药物的益处。

研究表明，CAM在AIV感染期间保护了TOCs和LCs，但感染并未完全消除，这表明产生的HA0病毒可能被CAM无法影响的其他蛋白酶切割，例如在人气道中描述的HAT，这需要在鸡中进行进一步研究。研究人员观察到H9N2和H6N8在CAM处理下复制率的差异，这可能归因于两种病毒HA切割特性的差异。

鸡LCs是研究宿主-病原体相互作用的宝贵模型。本研究展示了鸡LCs可用于在LPAIV背景下评估蛋白酶抑制剂的靶向治疗效果，这扩展了在禽类中研究治疗方法的适用范围。

本研究也存在一些局限性。例如，没有区分气管的上部和下部，而是随机分配。尽管TMPRSS2敲除与WT DF-1细胞之间存在显著差异，但从具有高TMPRSS2表达的组织（如气管或肺）开发进一步模型将是有益的。DF-1细胞中的CRISPR/Cas9靶向证明了该模型在评估鸡宿主蛋白酶方面的实用性，这可能为未来生成具有修饰或敲除蛋白酶结构域的基因编辑鸡开辟道路。然而，可能需要多重基因修饰来防止逃逸突变体的出现，因为仅修饰TMPRSS2样蛋白酶不太可能实现完全免疫。

总之，本研究的数据表明，靶向鸡TMPRSS2及相关蛋白酶是限制禽流感病毒感染的一种有前途的策略。利用器官培养物评估治疗方法符合3R原则（替代、减少、优化），该模型能够研究与宿主-病原体相互作用相关的各种参数。随着耐药性问题日益严重和泛流行风险增加，迫切需要开发新的解决方案来预防传染病。这项研究为开发针对禽流感的新型抗病毒疗法提供了重要的实验依据和新的思路。